Brezvirusni način priprave iPSC

From Wiki FKKT

Jump to: navigation, search



Contents

Uvod

Z izražanjem določenih transkripcijskih faktorjev (kot najbolj pomembni so se izkazali Oct4 in Sox2 ter Klf4 in c-Myc ali Nanog in Lin28) v somatskih celicah lahko dosežemo reprogramiranje le-teh v tako imenovane inducirane pluripotentne matične celice (ali krajše iPS). Izkazalo se je, da so te celice molekularno in funkcionalno zelo podobne zarodnim matičnim celicam. Velik problem pri reprogramiranju pa predstavlja vključitev virusa (uporabili so retro in lentiviruse – svojo RNA z reverzno transkriptazo prepišejo v cDNA in le-to vključijo v gostiteljsko DNA s pomočjo integraze), s pomočjo katerega dosežemo povečano izražanje potrebnih transkripcijskih faktorjev, v genom naše celice. Največja učinkovitost reprogramacije celic, ki so jo s to metodo uspeli doseči se giblje okoli 0.01-0. 1%. Največji problem predstavlja velika nevarnost za nastanek tumorjev zaradi spontane reaktivacije virusnih transgenov. Tako so si znanstveniki prizadevali, da bi odkrili način priprave iPS brez integracije nevarnih virusov. Za prenos genskega materiala so uporabili adenoviruse in plazmide.

Načini transformacije

Adenovirusi

Gre za srednje velike ikozaedrične dsDNA viruse brez virusne ovojnice, ki so odgovorni predvsem za številne okužbe respiratornega sistema. Genom adenovirusa je velik med 26 in 45 kbp, kar omogoča zapis za 22 do 40 genov. Vstop virusa omogoča interakcija »knob« (gumb) domene na vlaknastem proteinu in celičnim receptorjem (CD46 in CAR). Nato sledi še ena ko-receptorska interakcija, ki omogoči internalizacijo adenovirusa – vstop preko endocitoze. V celici se virus oz. virion sprosti v citoplazmo in se s pomočjo mikrotubulov prenese do jedrne pore. Tam se virusna DNA sprosti in vstopi v jedro ter se poveže s histoni. Replikacija poteka v jedru gostiteljske celice s pomočjo replikacijskega sistema gostiteljske celice. Primarni transkript je razrezan na mRNA-je, ki so kompatibilni z gostiteljskimi ribosomi, kar omogoča nadaljno translacijo in sintezo proteinov. Ko so virusne komponente uspešno replicirane, se virus sprosti iz celice.

Z uporabo adenovirusov, za reprogramiranje celic, se uspemo izogniti integraciji večjih virusnih DNA fragmentov. Vendar je v primerjavi z retrovirusno metodo, ta postopek približno 1000-krat manj učinkovit, kar pomeni da je učinkovitost okoli 0.0001-0.001%, zato potekajo nadaljne raziskave, da bi odkrili ali lahko s spremenjenimi pogoji (različni substrati ali fizikalnimi pogoji) povečamo izkoristek metode.

Uporaba plazmidnih vektorjev

Transfekcija plazmidov, ki vsebujejo cDNA željenih transkripcijskih faktorjev, se je izkazala kot obetajoča metoda, saj ni moč zaznati vključitve plazmidov. Plazmid je majhna DNA molekula, ki se replicira neodvisno od kromosomske DNA. Uporaben je za vnos tuje DNA v celico, kjer se le-ta replicira. Tako lahko dodatno izražamo željene proteine.

Za pripravo multicistronskih vektorjev uporabimo kratke (18-22 AK) 2A peptidne sekvence. Te omogočajo stehiometrično sintezo večih proteinov znotraj istega vektorja, ker imajo divergentne amino-terminalne sekvence. To zelo zmanjša možnosti za homologno rekombinacijo in omogoča porabo večih 2A peptidnih sekvenc znotraj istega vektorja. Geni, ki so med temi 2A sekvencami, so popolnoma ločeni.Takšno povezavo med 2A peptidno sekvenco in vektorjem na kratko imenujem tudi reprogamska »kaseta« (»reprograming cassette«). Z uporabo piggyBac transpozona (PB transposon delivery system) so uspeli vektor specifično vgraditi v gostiteljsko DNA, kar dodatno zmanjša vpliv integracije vektorja na genom. V vektorju so uporabili tudi CAG promotor, ki je manj podvržen utišanju. Tako so dosegli relativno visoko stopnjo učinkovitosti pri reprogramiranju. Odstranitev zunanjih faktorjev s Cre rekombinazo ne vpliva na vzdrževanje iPS stanja. Integriran vektor lahko odstranimo s pomočjo PB transpozona. Izmerjena učinkovitost metode je večja od obeh prej omenjenih metod in znaša približno 2.5%.

piggyBac trnaspozon

Je mobilen gentski element, ki učinkovito »transpozira« oz. se prenaša med vektorji in kromosomi z t.i. »reže in lepi« mehanizmom ("cut and paste" mechanism). Med transpozicijo PB transpozaze prepoznajo transposon-specifična invertna terminalna ponovitvena zaporedija (ITRs), ki se nahajajo na koncih transpozonskega vektorja. Tako se transpozonski vektor učinkovito prenese iz izvirnega mesta v TTAA kromosomska mesta. Hkrati je možna tudi odstranitev transpozona s kromosoma.

Cre rekombinaza

Gre za encim iz družine integraz, ki nadzira speceifične rekombinacije, s pomočjo mehanizma topoizomeraze I . S pomočjo rekombinaze lahko modificiramo (insercije, delecije, translokacije) DNA. Omogoča integracijo željenih vektorjev in kasneje njihovo odstranitev.

Potek dela raziskave

Za razvoj pluripotentnosti v celicah je potrebno izraziti nekatere transkripcijske faktorje. Raziskovalci so klonirali cDNA Oct4, Sox2, c-Myc, Klf4 ter jih vnesli v replikacijsko nesposobne adenovirusne vektorje s pomočjo človeškega citomegalovirusnega zgodnjega promotorja. Poskusi, da bi reprogramirali fibroblaste mišjega repa so bili neuspešni, domnevno zaradi razredčitve sintetiziranih proteinov (iz celice).

Jetrne celice

Za naslednje poskuse so uporabili mišje jetrne celice, ki v prisotnosti doksiciklina izražajo Oct4 in za reprogramiranje potrebujejo manjše število virusnih delcev kot pa fibroblasti. Okužili so ~500,000 Oct4 mišjih jetrnih celic z adenovirusi, ki so izražali Sox4, Klf4 in c-Myc (razmerje med številom virusov in celic je bilo 20 do 50). 20 – 30 % vseh celic je izražalo vse tri transkripcijske faktorje. 9 kolonij, podobnih iPS celicam je bilo vidnih na gojišču po 24 – 30 dnevni inkubaciji v prisotnosti doksiciklina. Celice so nadalje rasle tudi brez doksiciklina, kar je pokazalo, da transgeno izražanje Oct4 ni bilo več potrebno.

Fibroblasti

Po enakem postopku so ponovno poskusili pripraviti iPS celice repnih fibroblastov. Uporabili so fibroblaste, ki v prosotnosti doksiciklina izražajo Oct4 konjugiran z zelenim fluorescenčnim proteinom (GFP). Po inkubaciji 1,000,000 celic je ostala ena GFP+ kolonija, ki je porasla v stabilno celično linijo.

Da bi ugotovili ali lahko transformirajo celice tudi brez transgenega izražanja Oct4, so inkubirali mišje jetrne celice transfecirane z Oct4-GFP (zaradi nizkega razmerja med številom jetrnih celic in virusov, ki privede do okužbe) z virusi, ki so nosili zapis za vse štiri proteine. 60 % vseh celic je izražalo vse štiri faktorje. Pridobili so tri kolonije, ki so jih razširili v stabilne celične linije.

S qPCR reakcijo so preverili ali adeno-iPS celice izkazujejo pluripotentnost tudi na molekulskem nivoju. Ekspresijska analiza endogenih markerjev za pluripotentnost se ni razlikovala od embrionalnih matičnih celic (ES). Zaznana je bila tudi demetilacija promotorjev Oct4 in Nanog v enaki meri, kot je to značilno za ES. Znano je, da se lahko adenovirusni vektorji v zelo majhni meri inkorporirajo v gostiteljsko DNA. Da bi izključili možnost stalne vključitve virusne DNA, so naredili PCR reakcijo z začetnimi oligonukleotudi, ki prepoznajo virusne dele DNA. Signala, ki bi nakazoval prisotnost take DNA niso zaznali. S tehniko prenos »Southern« so poskušali ugotoviti prisotnost eksogenih virusnih zaporedij, ki jih pravtako ni bilo mogoče zaznati.

Razvojna učinkovitost

Da bi dokazali razvojno učinkovitost adeno-iPS celic so jih vnesli v SCID miši. Vse testirane celične linije so po 3-4 tednih proizvedle teratome, ki so po histološkem testiranju pokazale diferenciacijo v specifičo tkivo. Odrasli samci, vzgojeni iz FL-9 in TTF-1 adeno-iPS celic so zaplodili potomce, ki so imeli za adeno-iPS celice specifično barvo dlake (agouti).

Zaključek

Za indukcijo nastanka pluripotentnih celic, so nam trenutno navoljo tri preizkušene tehnike. Prva, ki se je izkazala za uspešno je temeljila na integraciji inducirajočih faktorjev v DNA gostiteljske celice s pomočjo retrovirusov. Metoda ima učinkovitost v območju 0.01-0.1%. Vendar se je kljub temu izkazala za neprimerno, saj vgrajena virusna DNA močno poveča tvegneje za tumorogenezo.

Druga metoda je za vnos genov inducirajočih faktorjev uporabila adenoviruse, ki svoje DNA ne vgrajujejo v gostiteljsko DNA. Vendar ima tudi ta metoda pomankljivosti, saj je potrebno celice konstantno spirati z raztopino virusov, preden se te uspejo petvoriti v pluripotentne. Celice razičnih tkiv so različno občutljive na virusno infekcijo in kljub temu, da adenovirusi ne vgrajujejo lastne DNA v gostiteljsko, le tega niso uspeli popolnoma potrditi. Dodatna pomankljivost metode je njen nizek izkoristek, ki znaša komaj 0.0001-0.001%.

Zadnja metoda uporablja t.i. reprogramsko kaseto, ki jo sestavljata 2A peptidna sekvenca in vektor, dodatno pa se uporabita še piggyBac transpozon in Cre rekombinaza. Slednja skrbita za odstranitev vektorske DNA iz gostiteljske DNA in tako močno zmanjšata vpliv metode na genom. Takšen način reprogramiranja je zelo obetaven, saj minimira vpliv postopka na genom in ima največji izkoristek izmed vseh treh metod (2.5 %). Kljub temu, da ima metoda reprogramske kasete najvišji izkoristek, je bilo izvedenih še premalo raziskav, da bi lahko zagotovo trdili, da je izmerjeni izkoristek tudi realen, saj na učinkovitost metode lahko vpliva več faktorjev, ki še niso določeni.

Tako je trenutno najbolj zanesljiva metoda uporaba adenovirusov, saj so raziskave že potrdile njeno zanesljivo učinkovitost in uporabnost ter zanemarljiv vpliv na genom reprogramirane celice.

Viri:

- Stadtfeld M. in sod. Induced pluripotent stem cells generated without viral integration. Science, 2008, letn. 322, str. 945-949.

- Okita K. in sod. Generation of mouse induced pluripotent stem cells without viral vectors. Science, 2008, letn. 322, str. 949-953.

- Kaji K. in sod. Virus-free induction of pluripotency and subsequent excision of reporgramming factors. Nature, 2009, letn. 458, str. 771-776.

- Edilamar Menezes Oliveira and M Ian Phillips (2011). Associated Adeno Virus Vector for Producing Induced Pluripotent Stem Cells (IPS) for Human Somatic Cells, Stem Cells in Clinic and Research, Dr. Ali Gholamrezanezhad (Ed.), ISBN: 978-953-307-797-0, InTech, Available from: http://www.intechopen.com/books/stem-cells-in-clinic-and-research/associated-adeno-virus-vector-forproducing-induced-pluripotent-stem-cells-ips-for-human-somatic-cel

- Szymczak L. A. in sod. Correction of multi-gene deficiency in vivo using a single ‘self-cleaving’ 2A peptide–based retroviral vector. Nature biotechnology, 2004, letn. 22, str. 589 – 594.

- Wikipedija, prosta enciklopedija [online], Vector (molecular biology) [18. 5. 2013]: http://en.wikipedia.org/wiki/Vector_%28molecular_biology%29;

- Cre-Lox recombination [16.5.2013]: http://en.wikipedia.org/wiki/Cre-Lox_Recombination;

- Adenoviridae [18. 5. 2013]: http://en.wikipedia.org/wiki/Adenoviruses

Personal tools