CelloSelect – sintetična celobiozna presnovna pot za izbor stabilnih transgenih celičnih linij CHO

Izhodiščni članek: https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S1096717622000015

Uvod

Protokoli, ki se danes uporabljajo za ustvarjanje transgenih celičnih linij, temeljijo na uporabi antibiotikov in specializiranih celičnih linij, ki jim manjka del njihove metabolne poti. Vse to pa vodi v uporabo potencialno nevarnih snovi in celičnih linij z izbitimi geni, kar lahko zmanjša produktivnost. Večina sesalskih celic za svoje preživetje ne more izrabiti ogljikovega hidrata celobioze, disaharida, ki nastane preko povezave dveh molekul glukoze, povezanih z β(1-4) glikozidno vezjo. V raziskovalnem delu so raziskovalci predstavili novo metodo imenovano CelloSelect, ki se uporablja pri ustvarjanju stabilnih celičnih linij z uporabo celobioze. CelloSelect je neodvisen od antibiotikov in ne zahteva izločanja endogenih encimov. V nasprotju z mikroorganizmi in glivami, večina celic sesalcev ne more presnoviti celobioze. Z CelloSelectom so raziskovalci iznašli način, da sesalske celice preživijo z metaboliziranjem celobioze tako, da so uvedli heterologno metabolno pot izrabe celobioze, pridobljene iz glive Neurospora crassa, s čimer so celice sesalcev obdarili s sposobnostjo preživetja in rasti na celobiozi kot edinem viru ogljika. Rezultati kažejo, da ta pristop zagotavlja novo in učinkovito strategijo za ustvarjanje stabilnih celičnih linij brez uporabe antibiotika ali škodljivih kemikalij [1].

Rezultati

Oblikovanje poti izrabe celobioze

Ustvarili so tri genetske konstrukte, ki kodirajo za izražanje bodisi transporterja celulodekstrina (CDT1) iz glive N. Cassa, bodisi β-glukozidaze (GH1) ali pa obeh, ki pa sta ločena s peptidom T2A, ki je podvržen cepljenju. Peptid obdajajo končne ponovitve ITR, ki temeljijo na tranaspeptidazi imenovani PiggyBac. Da so preverili funkcionalnost konstruktov, so celice CHO-K1 transfecirali ločeno z vsakim izmed plazmidov, prav tako pa so izvedli transfekcijo obeh skupaj. Kot pozitivna kontrola so služile celice, ki so jih po prvotnem 48-urnem gojenju v mediju gojili še dodatnih 48-ur v mediju z glukozo. Ostale celice so po prvotnem 48-urnem gojenju v mediju, nato še dodatno gojili v mediju bogatem z celobiozo, vendar brez glukoze. Kot negativna kontrola pa so jim služile celice, ki so jih gojili v mediju brez glukoze in tudi brez celobioze. Da so potrdili samo funkcionalnost izrabe celobioze za preživetje celic, so predhodno transfecirane celice gojili v mediju, ki je vseboval resorufin-β-D-celobiozid ter opazovali sproščanje flourescenčnega produkta resurofina. Sproščanje resurofina so opazili v celicah, ki so izražale samo β-glukozidazo oz., ki so izražale tako β-glukozidazo kot celodekstrinski transporter (bodisi v ločenih konstruktih ali v kombinaciji) [1,2].

Vzpostavitev optimiziranega protokola CelloSelect v adherentnih celičnih kulturah CHO-K1

Nato so raziskovali vpliv števila pritrjenih celic, koncentracijo FBS reagenta ter koncentracijo celobioze na preživetje celic. Celice CHO-K1 so kotransfecirali s plazmidom, ki kodira za hiperaktivno PiggyBac transpozazo in celotnim sistemom CelloSelect, ki vsebuje še zapis za flourescenčni protein citrin. Ugotovili so, da nižje koncentracije celobioze in FBS povečajo odstotek flourescenčnih celic in večje število pritrjenih celic poveča samo preživetje le-teh. Optimalni pogoji za selekcijo so bili pri 0.3x106 celic/ml, 5%FBS, 0.125g/L celobioze, ki naj bi privedli do 73% izplena flourescenčnih celic. Nato so ponovili transfekcijo CelloSelecta pri optimalnih pogojih ter analizirali koncentracijo flourescenčnega proteina ter število celic štiri dni zapored. Po štirih dneh so potrdili, da je v transfecirani kulturi več kot 85% flourescirajočih celic, medtem ko so netransfecirane celice in pa celice z medijem brez sladkorja bile po treh dneh skoraj popolnoma izčrpane. Potrdili so preživetje celic, ki so bile predhodno transfecirane z celotnim CelloSelect sistemom ali pa samo z zapisom za GH-1. Hkrati so dokazali, da je Celodekstrinski transporter CD1 nujen za preživetje celic pod selekcijskimi pogoji [1].

Uporaba za stabilno proizvodnjo biofarmacevtskih beljakovin v celicah CHO-K1

Za ponazoritev uporabe sistema CelloSelect so izbrali biofarmacevtski protein eritropoetin. Želeli so ustvariti protein celotne dolžine, zato so na C-končnem delu uporabili fuzijo s furinom T2A in tako so povezali gen za eritropoetin s selekcijsko kaseto [3]. Zaradi prisotnega peptida T2A se fuzijski protein prevaja ločeno v samostojni protein. Eritropoetin je sekretorni protein, ki se nato transportira v golgi, kjer najprej poteče cepitev furina, nato pa odstranitev C-terminalnih lizinov in argininov s pomočjo karboksipeptidaze. V želji po potrditvi, da imajo celice CHO-K1 endopeptidazno aktivnost, so jih transfecirali ločeno z dvema različnima konstruktoma, ki kodirata za konstituitivno izražanje izločenega proteina, ki je označen z oznako FLAG. Konstrukt ima na C-koncu majhno 18 aminokislin dolgo oznako, ki je ločena z cepitvenim mestom za furin (pMM83), drugi pa ima fleksibilni GS povezovalnik (pMM84). Analizo supernatanta celic so izvedli s prenosom Western in potrdili, da so bili pristoni krajši peptidi v vzorcu celic, ki je bil transfeciran s konstruktom, ki je vseboval furin. V naslednjem koraku so vzporedno transfecirali CHO-K1 celice z CelloSelect kaseto, ki je nosila zapis za citrin in eritripoetin.

Učinkovitost CelloSelect sistema v suspenziji celičnih kultur CHO-S

Želeli so preveriti ali CelloSelect sistem deluje tudi pri celicah seva CHO-S, ki rastejo v mediju brez protinov in seruma. Hkrati pa so primerjali učinkovitost CelloSelecta s selekcijskimi sistemi, ki temeljijo na dveh metabolnih markerjih GS in DHFR, ki se pogosto uporabljata v industrijskih procesih. Izdelali so tri konstrukte, ki kodirajo za zapis za protein citrin ali pa eritropoetin. Vsi konstrukti vsebujejo na obeh straneh ITR zaporedji, ki kodirata za transpozazo PiggyBac. Vse konstrukte so transfecirali v celice CHO-S, ki so bile v selekcijskem mediju z FMX8 sestavo [4]. Dokazali so, da je populacija celic na kateri je bila izvedena selekcija s celobiozo dosegla 95% hitrejšo ekspresijo citrina, kot pa populacija celic pod MSX (GS) in MTX (DHFR)selekcijo. Pokazali so, da so celice selekcionirane pod celobioznim sistemom stabilne do 60 dni v kulturi, pri čemer ohranijo do 99% flourescirajočih celic kot tudi podoben nivo ekspresije citrina. Po 15 dneh so analizirali populacijo celic, ki je izražala eritropoetin. Nenazadnje so ocenili ali bi selekcijska gena cdt1 in gh1 vplivala na presnovno obremenitev celic. Preverili so tudi ali bi dodatek celobioze k stabilnim celičnim linijam, ki rastejo na glukozi imela vpliv na celično rast in pa produktivnost. Primerjali so rastne vzorce celic CHO-S, ki izražajo citrin in pa netransformirane celice CHO-S v mediju, ki je vseboval glukozo (30Mm), v prisotnosti in pa odsotnosti celobioze (2g/L). Ugotovili so, da so vzorci rasti celic v obeh primer zelo podobni, zato so sklepali, da selekcijski geni nimajo vpliva na metabolično obremenitev celic. Prav tako so potrdili, da celobioza nima negativnega vpliva na celično rast in produkcijo rekombinantnega proteina.

Uporaba Celloselect sistema za proizvodnjo monoklonskih protiteles pri kultivaciji s hranjenjem

S pomočjo sistema CelloSelect so ovrednotili stabilno izražanje modelnega monoklonskega protitelesa Rituksimaba, ki je eden izmed najuspešnejših proteinskih terapevtikov, ki so proizvedeni v celicah linije CHO. Celice CHO-S so bile transfecirane z ekspresijskim sistemom CelloSelect, ki kodira za težke in lahke verige rituksimaba. Zapisa sta med seboj ločena z zapisom za cepitveni protein T2A (pAna264) in zbrane v mediju, ki vsebuje celobiozo 12 dni. S kvantitativnim PCR so analizirali število uspešno integriranih kaset z zapisom za PiggyBac transpozazo v genomu celic. Celice, ki izražajo citrin in rituksimab, so imele v genomu povprečno 10 in 13 kaset CelloSelect sistema, kar je podobno vrednostim, ki so dosežene ob uporabi antibiotikov za selekcijo. Serijsko gojenje s hranjenjem je prednostno pred šaržnim gojenjem, saj se pri serijskem hranilo konstantno dodaja. Dokazali so, da so kulture gojene v serijskem gojenju s hranjenjem dosegle višje gostote celic, kot pa pri šaržnem gojenju, prav tako, pa se je povečala tudi sposobnost preživetja celic [1].

Zaključek

Metabolni inženiring v celicah sesalcev se osredotoča predvsem na izboljšan izplen rekombinantnega proteina za zmanjšanje stranskih produktov in za povečanje preživetja celic med gojenje. V delu so raziskovalci predstavili nov pristop selekcije, kjer so izvedli prenos heterologne presnovne poti iz glive N.Crassa v sesalske celice. Dokazali so, da uporaba celobioze omogoči preživetje in razmnoževanje konstruiranih celic na mediju brez glukoze, ki vsebuje celobiozo. Sesalske celice navadno ne morejo presnavljati celobioze, ta sistem pa omogoči specifično in učinkovito selekcijo CHO-K1 celic, ki stabilno izražajo metabolne encime za uspešno presnovo celobioze. Z eksperimentom, kjer so ustvarili stabilne linije, ki so proizvajale protein eritropoetin so pokazali, da je na tak način mogoče celice gojiti dalj časa. V primerjavi z izbirnimi metodami, ki temeljijo na antibiotikih, ima CelloSelect prednost uporabe netoksičnega selekcijskega sredstva, ki omogoča stalno vzdrževanje selekcijskega tlaka in potencialno zmanjša potrebno količino nadaljnje obdelave.

Viri in literatura

[1] Matasci, M., Baldi, L., Hacker, D. L. & Wurm, F. M. The PiggyBac transposon enhances the frequency of CHO stable cell line generation and yields recombinant lines with superior productivity and stability. Biotechnology and Bioengineering 108, 2141–2150 (2011).

[2] Lin, J. et al. Impact of Signal Peptides on Furin-2A Mediated Monoclonal Antibody Secretion in CHO Cells. Biotechnology Journal 12, 1700268 (2017).

[3] Zhang, J. Mammalian Cell Culture for Biopharmaceutical Production. Manual of Industrial Microbiology and Biotechnology 157–178 (2014) doi:10.1128/9781555816827.CH12.

[4] Teixeira, A. P. et al. CelloSelect – A synthetic cellobiose metabolic pathway for selection of stable transgenic CHO cell lines. Metabolic Engineering 70, 23–30 (2022).