Ecolibrium – razvoj ogrodja za inženiring mešanih kultur

From Wiki FKKT

Jump to: navigation, search

Imperial College London, Ecolibrium – developing a framework for engineering co-cultures [1]

Contents

Uvod

Za bazično raziskovanje in tudi pri tehnoloških bioprocesih večinoma uporabljamo čiste kulture mikroorganizmov, čeprav se ti v naravi povezujejo v združbe, v katerih interagirajo in sodelujejo, na primer s proizvajanjem metabolitov, ki jih drugi organizmi uporabijo kot substrat. Takšne dinamične in simbiotske interakcije omogočajo učinkovit pretok ogljika in energije, hkrati pa izboljšujejo odziv združbe na hitre in neugodne okoljske spremembe. Sicer so monokulture trenutno enostavnejše za uporabo, saj sta za enkrat nadzor procesa in priprava kulture z genetskih inženiringom lažja, vendar so lahko prisotni problemi, kot je nabiranje stranskih produktov in neučinkovit pretok energije in ogljika. Uporaba sinteznih mešanih kultur oz. večceličnega inženiringa je zato lahko učinkovita rešitev, ki bi izboljšala ekonomičnost bioprocesov. Vendar je gojenje mešanih kultur pogosto oteženo, saj imajo različne celice različne optimalne pogoje rasti, kar lahko vodi v preraščanje ene vrste celic preko drugih. Trenutno se raziskovalci teh problemov lotevajo z različnimi metodami kontrole rasti, ki temeljijo na avksotrofiji in sistemih toksin-antitoksin. Ampak te metode niso robustne in ne omogočajo natančnega nadzora razmerja med različnimi populacijami v mešani kulturi ter hkrati niso prenosljive med različnimi organizmi.

Ekipa iz Imperial College-a v Londonu je v ta namen razvila genetsko vezje G.E.A.R. (Genetically Engineered Artificial Ratio), ki bi omogočalo stabilno ohranjanje razmerja rasti različnih celic v kulturi. Hkrati so izdelali tudi podatkovno bazo A.L.I.C.E. (Advanced Logging Interface for Culture Experiments), ki omogoča podporo pri načrtovanju in optimizaciji procesov z mešanimi kulturami.

G.E.A.R

Genetsko vezje G.E.A.R. je sestavljeno iz treh modulov:

  • komunikacijskega, sestavljenega iz dveh ortogonalnih sistemov, ki temeljita na zaznavanju celične gostote,
  • primerjalnega, ki povezuje signale iz sistema za zaznavanje celične gostote z RNA logičnim omrežjem in omogoča celicam primerjavo gostote lastne populacije z gostoto populacij drugih celic in
  • modula za uravnavanje rasti, ki se v primeru ustreznega signala iz primerjalnega sistema odzove z zaustavitvijo rasti v celicah določene populacije.

Komunikacijski modul

Prvi modul omogoča komunikacijo med celicami znotraj populacije in med populacijami ter temelji na v naravi prisotnem mehanizmu zaznavanja celične gostote (angl. quorum sensing), pri katerem celice proizvajajo signalne molekule, kor so na primer N-acil homoserin laktoni (AHL). Ti se vežejo na ustrezne transkripcijske faktorje, ki spremenijo vzorec izražanja genov. Ker so pri eksperimentih uporabili mešanico dveh kultur E. coli, so potrebovali sistem za dvosmerno komunikacijo z dvema edinstvenima in ortogonalnima sistemoma AHL z ustreznim odzivnim proteinom, tako da je vsaka populacija lahko zaznavala lastno gostoto in gostoto druge populacije.

Analizirali so 4 sisteme:

  • Cin s transkripcijskim aktivatorjem CinR in signalno molekulo 3O-C14 AHL,
  • Las s transkripcijskim aktivatorjem LasR in signalno molekulo 3O-C12 AHL,
  • Lux s transkripcijskim aktivatorjem LuxR in signalno molekulo 3O-C6 AHL in
  • Rhl s transkripcijskim aktivatorjem RhIR in signalno molekulo C4 AHL.

Signalno molekulo v vsakem sistemu sintetizira različen induktorski protein. Za vsak sistem so izdelali dva sestavljena dela. Prvi del je predstavljal AHL odzivni sistem s transkripcijskim aktivatorjem (CinR, LasR, LuxR ali RhIR) pod kontrolo konstitutivnega promotorja, ki mu je sledil odgovarjajoči promotor za odziv na celično gostoto. Pri tem sistemu se v ustrezni AHL veže na konstitutivno izražen aktivator, ki aktivira transkripcijo gena navzdol od promotorja, odzivnega na aktivator. Drugi sestavljeni del je reporterski in se od odzivnega razlikuje po tem, da je za promotorjem odzivnim na celično gostoto zapis za GFP. Ta del so uporabili za karakterizacijo odziva posameznega sistema na različne koncentracije AHL in tudi za analizo navzkrižne reaktivnosti. Pri analizah koncentracijskega območja vsakega sistema so ugotovili, da se sistemi razlikujejo glede na območja, v katerih je sistem aktiven in glede na pridobljene podatke lahko ustrezno spremenili moč uporabljenega promotorja, bodisi konstitutivnega promotorja navzgor od gena za transkripcijski aktivator ali navzgor od gena za protein, ki sintetizira signalni AHL. Pri analizah navzkrižne reaktivnosti, kjer so spremljali jakost fluorescence enega sistema pri indukciji z AHL iz drugih sistemov, so ugotovili, da sta sistema Rhl in Las najbolj ortogonalna in zato najbolj uporabna za končno vezje G.E.A.R. Hkrati so iz literature imeli podatek, da sta ortogonalna tudi sistema Cin in Rhl .

Primerjalni modul

Primerjalni modul primerja količino AHL iz dveh sistemov in ustvari signal, ki deluje na končni, rastni modul. Temelji na RNA-tehnologiji STAR (Small Transcriptional-Activating RNA), pri kateri male molekule RNA uravnavajo transkripcijo genov tako, da se vežejo na promotorske regije s komplementarnimi zaporedji. Ta zaporedja tvorijo lasnično zanko, ki preprečuje vezavo RNA-polimeraze in s tem transkripcijo. Vezava STAR strukturo spremeni tako, da se RNA-polimeraza lahko veže in zato transkripcija lahko poteče. V svojem vezju so uporabili dva sistema. Prvi sistem je vključeval zapis za STAR pod kontrolo promotorja, ki se odziva na transkripcijski aktivator, odziven na AHL lastne populacije. Za drugi sistem so načrtali zaporedje, katerega produkt je anti-STAR, molekula RNA komplementarna STAR. Ko je anti-STAR prisoten, veže STAR in prepreči aktivacijo transkripcije. Zapis za anti-STAR so vstavili za zaporedje promotorja odzivnega na AHL, ki ga proizvaja populacija drugih celic. Razmerje med med STAR in anti-STAR je zato enako razmerju med dvema AHL v mešani kulturi. V primeru, da je gostota celic enaka, sta enaki tudi količini STAR in anti-STAR, in obe populaciji rasteta normalno. Če pa pride do neenakovredne hitrosti rasti populacije, se poveča količina STAR v celicah te populacije, ki se veže na lasnično zanko v modulu za uravnavanje rasti in sproži zaustavitev rasti. Sestavili so tudi sistem za karakterizacijo, ki je vključeval plazmid z zapisom za STAR pod kontrolo konstitutivnega promotorja in plazmid za zapisom za SFGFP (superfolder GFP) navzdol od tarčnega zaporedja za STAR. Ugotovili so, da se izražanje reporterskega proteina poveča za 17-krat že v prvih 100 minutah gojenja, kar pomeni, da je sistem sposoben hitrega odzivanja. Ugotovili so tudi, da je učinkovitost aktivacije izražanja približno 5-krat večja pri 37°C kot pri 30°C, kar je pomembno za prilagajanje sistema za uporabo pri različnih pogojih rasti.

Uporaba sistema STAR naj bi imela številne prednosti pred klasičnimi regulatornimi sistemi, ki temeljijo na proteinih:

  • pri RNA ni translacije, ki sicer obremeni celico;
  • sistem trans-delujočih RNA je prenosljiv med različnimi organizmi;
  • izražanje gena navzdol od zaporedja komplementarnega STAR je v odsotnosti STAR zelo nizko v prisotnosti pa precej visoko, torej je regulacija zelo robustna;
  • načrtovanje komplementarnih interakcij DNA-RNA je precej bolj enostavno od interakcij med proteini;
  • hitra razgradnja RNA izboljšuje odzivost sistema.

Modul za uravnavanje rasti

Modul za uravnavanje rasti se odziva na signal iz sistema STAR, pri čemer se v primeru, da je rast ene populacije hitrejša, sproži prepisovanje gena, katerega produkt povzroči hitro zaustavitev rasti, brez da bi celica umrla. Analizirali so 4 možne gene, katerih produkti zaustavijo celično rast:

  • cat, ki zapisuje za kloramfenikol acetiltransferazo in
  • leuB, ki zapisuje za encim v biosintezni poti levcina.

Pri obeh zgornjih proteinih je njuno izražanje potrebno za normalno rast, zato bi vezava STAR morala sprožiti transkripcijo proteina, ki bi deloval kot inhibitor izražanja cat ali leuB (inverter).

  • Gp2, ki je gen iz bakteriofaga T7 in inhibira celično rast tako, da se veže na kompleks RNA-polimeraze v E. coli in s tem inhibira transkripcijo in
  • Gp0.4, ki je prav tako gen iz bakteriofaga T7 in se veže na obroč FtsZ med mitozo, s čimer prepreči citokinezo.

Po prvih analizah so se osredotičili na Gp2, ki za razliko od cat in leuB ne potrebuje uvajanja dodatnega inverterja v sistem in je od obeh genov tudi precej krajši, kar omogoča hitrejše izražanje in hitrejši odziv. Za razliko od leuB tudi nismo omejeni na avksotrofne seve oz. nam ni potrebno pripraviti mutant z izbitimi geni. Gen cat tudi ni idealen zaradi uporabe antibiotika in nevarnosti razvoja bakterijske odposrnosti. Pri obeh je potrebno uporabiti tudi posebno gojišče. Gp0.4 zaradi težav z ligacijo niso uporabili, vendar ga načrtujejo v prihodnosti okarakterizirati.

A.L.I.C.E

Sistem G.E.A.R odgovarja na problem uravnavanja rasti različnih populacij v mešanih kulturah, vendar moramo za uspešno gojenje še vedno določiti optimalne pogoje rasti mešane kulture. Zato so ustvarili bazo podatkov A.L.I.C.E (Advanced Logging Interface for Culture Experiments), ki vključuje eksperimentalne podatke o optimalni pogojih rasti za monokulture in tudi za mešane kulture, protokole in druge podatke.

Zaključek

Uporaba mešanih kultur lahko precej izboljša obstoječe bioprocese in odpira možnosti za razvoj novih. Genetsko vezje G.E.A.R ponuja zanimiv način razvoja stabilnih mešanih kultur, ki pa mora biti še preizkušen in optimiziran kot celota. Ekipa iz Imperial College-a je prispevala nove konstrukte in njihove karakterizacije ter karakterizacije že obstoječih konstruktov, ki so uporabni v sistemu za nadzor rasti populacij in s tem pomembno prispevala k napredku uporabe mešanih kultur.

Literatura

  • Santala, S., Karp, M. in Santala V. (2014) Rationally Engineered Synthetic Coculture for Improved Biomass and Product Formation. PLOS ONE 9(12): e113786. doi: 10.1371/journal.pone.0113786.


Seminarji SB 12016/17

Personal tools