Gutail Floractory - probiotične bakterije za zaščito črevesja pred vnetji

Projekt »Gutail Floractory« je sodeloval na tekmovanju iGEM 2021 ter se uvrstil med najboljših 10 v kategoriji znanost in tehnologija. Zasnovala ga je skupina SZU-CHINA, ki je želela narediti 'koktejl' prilagojenih in gensko spremenjenih črevesnih probiotikov kot adjuvans za lajšanje kronične vnetne črevesne bolezni (KVČB). Predstavitev projekta je dostopna na spletni strani: Team:SZU-China

UVOD

KVČB je ponavljajoča in nespecifična vnetna reakcija v črevesni sluznici. Organi gastrointestinalnega (GI) trakta imajo posledično oslabljeno/okvarjeno delovanje, kar vodi do simptomov, kot so dolgotrajna driska, bolečine v trebuhu, rektalna krvavitev, izguba teže in utrujenost. KVČB delimo na Crohnovo bolezen (CB) in ulcerozni kolitis (UK). CB lahko prizadene katerikoli del GI trakta in vnetje se lahko razširi na celotno debelino črevesne stene. UK je omejen na debelo črevo in rektum, vnetje pa se pojavi le v notranji plasti črevesne sluznice. V redkih primerih je med CB in UK težko ločiti, zato takrat govorimo o intermediarnem kolitisu [2]. Natančna patogeneza KVČB je še vedno neznana, v splošnem pa velja, da je vnetje posledica nepravilnega imunskega odziva sluznice na črevesno floro v genetsko dovzetnih posameznikih. Eden glavnih patoloških mehanizmov KVČB je neravnovesje črevesne flore. Bolezen se v največjem merilu pojavlja v razvitih državah in prizadene 0,5 % populacije, v prihodnosti pa bo število bolnikov postopoma naraščalo [3]. Zdravljenje poteka z različnimi zdravili in striktno prehransko dieto. Glavni cilj je remisija (odsotnost simptomov), same bolezni pa ni mogoče popolnoma pozdraviti [2]. Konvencionalno zdravljenje z zdravili učinkuje le v omejenem obsegu, neželeni stranski učinki, visoki stroški in dolgotrajna zdravljenja, pa vplivajo na bolnikovo materialno in duševno stanje ter tudi na kakovost njihovega življenja. Poleg tega so bolniki s KVČB izpostavljeni večjemu tveganju za raka, krvne strdke in bolezni jeter [1,2].

CILJI PROJEKTA

KVČB otežuje življenje že več kot 10 milijonom ljudi iz vseh družbenih slojev. V predhodnih študijah je bilo ugotovljeno, da uporaba probiotikov, kot so mlečnokislinske bakterije in bifidobakterije, ob običajnem zdravljenju dosega boljše rezultate. V okviru projekta »Gutail Floractory« so zato želeli razviti bakterijski adjuvans za lajšanje bolnikovega nelagodja v času okrevanja, dolgoročno izboljšanje kakovosti bolnikovega življenja in celo zdravljenje bolnikov, ki se ne odzivajo na konvencionalne terapije. Šlo bi za pomožno vzdrževalno zdravljenje KVČB s koktejlom modificiranih inženirskih bakterij, ki bi jih vakuumsko liofilizirali in dozirali v kapsulah. Želeli so poiskati dejavnike, ki so povezani z napredovanjem bolezni KVČB, in izbrati štiri za potencialne tarče koktejl terapije. Glede na izbrane tarče bi oblikovali terapevtske elemente. Le-te bi predhodno modularizirali, s poudarkom na zamenljivosti promotorjev in odprtih bralnih okvirjev, da bi lahko poljubno spreminjali terapevtske gene in metode njihovega izražanja [1].

IZVEDBA

Izbira šasije

Zaradi zahtevnosti delovanja so za šasijo izbrali več bakterij [1]:

1) E. coli DH5α/BL21(DE3) – pogosto uporabljene inženirske bakterije, upali so, da v njih sistem ne glede na zahtevnost deluje.

2) E. coli Nissle 1917 – spada med probiotike, je nepatogena bakterija in lahko kolonizira. Lahko izraža mikrobektin, ki zavira rast nekaterih mikroorganizmov v vnetem črevesju.

3) Lactococcus lactis – mlečnokislinska bakterija, spada med probiotike. Pri UK je njihovo število zmanjšano, kar je lahko tesno povezano s patogenezo KVČB. Povezuje se jih tudi s spodbujanjem proizvodnje kratkoverižnih maščobnih kislin. Zaradi časovne omejitev te šasije niso uspeli testirati.

Terapevtske tarče

V raziskavi so našli veliko število dejavnikov, ki so povezani z napredovanjem KVČB. Med njimi so za terapevtske tarče koktejl terapije, na podlagi najboljše izvedljivosti le-te, izbrali štiri: spremembe v proizvodnji maslene kisline, lipopolisaharida in antibakterijskega proteina LL-37, superoksid dismutaze (SOD) in hidrolaze žolčnih soli (angl. bile salt hydrolase, BSH).

Maslena kislina: Kratkoverižna maščobna kislina, katere proizvodnja je pri bolnikih s KVČB zmanjšana. Maščobne kisline so izjemno pomembne pri ohranjanju zdravja debelega črevesa, saj med drugimi predstavljajo glavni energijski vir za epitelijske celice in zavirajo vnetni odziv. Maslena kislina velja za idealno zdravilo za zdravljenje KVČB, vendar je ni mogoče dozirati peroralno. V sintezni poti maščobnih kislin družina tioesteraz prekine podaljšan cikel maščobnih kislin in sprostijo se proste maščobne kisline, katerih dolžina je odvisna od vrste tioesteraze. Za terapevtski gen so izbrali tioesterazo Tes4 iz Bacteroides polymorpha (biokocka: BBa_K3838613) [1,4].

LL-37: Pri bolnikih z UK je zaradi neuravnotežene črevesne flore spremenjena pregradna funkcija in prepustnost sluznice, zato gramnegativne bakterije vstopijo v limfni in krvni sistem, njihov lipopolisaharid pa stimulira imunski sistem. LL-37 je antibakterijski peptid, ki ga izločajo človeške imunske celice in zavira nekatere škodljive bakterije. Koncentracija tega peptida (1-5 μg/ml), ki se običajno nahaja pri odraslih na površini sluznice, je prenizka za neposredno uničenje bakterij, vendar pa sodeluje pri imunski regulaciji in ščiti človeško telo pred endotoksemijo. Verjamejo, da bi z bakterijami, ki eksokrino izločajo LL-37, izboljšali vnetno stanje (biokocka: BBa_K3838555) [1,5].

SOD: ROS poškodujejo lipide, proteine, nukleinske kisline, uničijo integriteto epitelijskih celic, so vključeni v različne znotrajcelične signalne poti in spodbujajo vnetni odziv. Črevesna sluznica ima kompleksen antioksidativni sistem, v katerem je SOD začetni encim za delovanje celotnega sistema. Pri bolnikih s KVČB je ta sistem okvarjen. Neposredno povečanje količine SOD v bolnikovem črevesnem traktu ni mogoče, zaradi zelo kratke razpolovne dobe. Za dolgoročne in stabilne terapevtske učinke je zato potreben eksokrini ekspresijski bakterijski sistem (biokocka: BBa_K3838233) [1,6].

BSH: BSH katalizira hidrolizo konjugiranih žolčnih soli, pri čemer se sproščajo prosta žolčna kislina in aminokisline. Aktivnost BSH v prebavilih izvira predvsem iz Firmicutes, Bacteroides in Actinomycetes, njihova številčnost pa je pri bolnikih s KVČB zmanjšana, kar vodi do motene presnove žolčnih kislin in povečanega vnetnega odziva. Zaužitje probiotikov z aktivnostjo BSH lahko spodbudi biotransformacijo žolčnih soli v črevesju in s tem ublaži vnetni odziv (biokocka: BBa_K3838666) [1,7].

Izražanje

Že na začetku projekta so vedeli, da uporaba promotorja T7 ne bo mogoča. Zato so izbrali najpogostejši močni konstitutivni promotor J23100, ki je sicer manj učinkovit od ekspresijskega sistema s T7 promotorjem, vendar kljub temu zagotovi zadostno in stabilno izražanje terapevtskih učinkovin.

Pri bolnikih s KVČB je zaradi kopičenja ocetne in mlečne kisline v debelem črevesju okolje kislo. Za dosego potrebne regulativne funkcije so uporabili promotor PrcfB ekipe SZPT-China 2019 [1]. Gre za izboljšano različico kislinskega promotorja p170 z višjo učinkovitostjo izražanja. Promotorju p170 je dodana operatorska regija, na katero se ob kislih pogojih veže RcfB in inducira izražanje [8]. RcfB je endogeni protein mlečnokislinskih bakterij, v E. coli pa so ga vnesli pod konstitutivnim promotorjem s pomožnim vektorjem [1].

Vse štiri terapevtske gene so vnesli v ekspresijske vektorje (pUC18/pJSG/pET) s konstitutivnim promotorjem in transformirali izbrane bakterije: BL21(DE3), DH5α in Nissle 1917. Uspešnost in pravilnost izražanja proteina v pripravljenih bakterijah so preverili z gelsko elektroforezo, prenosom po Westernu in afinitetno kromatografijo. S tekočinsko kromatografijo so neposredno merili proizvodnjo terapevtskega produkta. Učinkovitost bakterij pri blaženju vnetnih simptomov pa so preverili z uporabo ustrezno pripravljene celične linije THP-1, ki je služila za tipičen model vnetja.

Terapevtski element Tes4, LL-37 on BSH so izražali v DH5α in Nissle 1917. Potrdili so izražanje Tes4 s povečano koncentracijo maslene kisline v obeh šasijah. V obeh šasijah se je izražal tudi BSH, izražanje LL-37 na proteinski ravni pa so preverili in potrdili le v DH5α. Izražanje SOD so raziskovali in tudi potrdili v vseh treh celicah, vendar v DH5α izločanje ni bilo eksokrino. S pomočjo celične linije THP-1, so za pripravljene bakterije Nissle 1917 s posameznim terapevtskim elementom uspešno potrdili zaviralne učinke na vnetje [1].

Varnost

Koktejl terapija vključuje kolonizacijo ustvarjenih bakterij v debelem črevesu, zato so morali poskrbeti za njihovo varno uporabo preko samomorilskega stikala in varne odpornosti.

Pripravljene bakterije niso smele vsebovati genov za odpornost proti antibiotikom, zato so v bakterije vnesli zapis za proteine toplotnega šoka (BBa_K3838777) in gen za odpornost proti triklosanu (BBa_K3838789). Pri toplotnem presejanju pri 55°C preživijo le bakterije, ki izražajo proteine toplotnega šoka, le te pa bi bakterijam pomagali tudi pri kolonizaciji v kislem okolju debelega črevesja. Dodatno presejanje se opravi s triklosanom, ki je varna antibakterijska snov in je odobrena s strani FDA.

Ustvarjene bakterije so zasnovali tako, da v zunanjem okolju, kjer je koncentracija glukoze nižja kot v črevesju, ne preživijo. Uporabili so promotor PT-αcrp, ki se odzove na spremembe v koncentraciji glukoze, in samomorilski gen mazF, ki zapisuje endoribonukleazo. Le-ta cepi RNA in povzroči celično smrt brez lize (biokocka: BBa_K3838654).

Želeli so preprečiti še prenos terapevtskih bakterij v kri, kjer je koncentracija fosfatov bistveno večja kot v črevesju. Uporabili so promotor PhoB, ki ga regulira endogeni na fosfat občutljiv faktor iz E. coli. Pri nizkih koncentracijah fosfata ga aktivira, pri visokih pa zavira. Aktiviran promotor PhoB sproži izražanje proteina tetR, ki pa zavira promotor pTet, pod katerim se izražal samomorilski gen (biokocka: BBa_K3838321) [1].

KONČNI PRODUKT

Njihova dolgoročna želja je vzpostaviti koncept imenovan zaprta zanka zdravljenja. Za vsakega bolnika posebej bi glede na njegovo situacijo prilagodili razmerje terapevtskih elementov v koktejl terapiji in tako dosegli natančno zdravljenje več dejavnikov. Razmerje bi prilagajali tako, da bi spreminjali deleže inženirskih bakterij s posameznim terapevtskim elementom ali uporabljali različne promotorje. Ustrezno razmerje bi določali na podlagi rednega zbiranja vzorcev pacientovega blata in analize metagenomskega zaporedja, s katero bi spremljali njihovo črevesno floro in zdravje. Trenutne naprave za zbiranje blata imajo veliko pomanjkljivosti (npr. nezmožnost zbiranja tekočega blata), zato so v sklopu projekta zasnovali komplet za vzorčenje blata, ki bi ga uporabljali tako pacienti kot tudi bolnišnice.

Želijo vzpostaviti tudi spletno platformo, ki bi glede na bolnikove rezultate analiz blata in dnevnih zapisov njihove prehrane, predpisovala ustrezno dieto. Poleg tega pa bi platforma služila uporabnikom tudi za medsebojno komunikacijo in jim pomagala pri psihični stiski [1].

VIRI

[1] “Team:SZU-CHINA - 2021.igem.org.” [Online]. Available: https://2021.igem.org/Team:SZU-China. [Accessed: 7-Apr-2022].

[2] Crohn's & colitis foundation of America: The facts about Inflammatory Bowel Diseases. New York, 2014.

[3] Yue B, Luo X, Yu Z, Mani S, Wang Z, Dou W. Inflammatory Bowel Disease: A Potential Result from the Collusion between Gut Microbiota and Mucosal Immune System. Microorganisms. 2019, 7(10), 440.

[4] Van Immerseel F, Ducatelle R, De Vos M, Boon N, Van De Wiele T, Verbeke K, Rutgeerts P, Sas B, Louis P, Flint HJ. Butyric acid-producing anaerobic bacteria as a novel probiotic treatment approach for inflammatory bowel disease. J Med Microbiol. 2010, 59(Pt 2), 141-143.

[5] Mookherjee N, Brown KL, Bowdish DM, Doria S, Falsafi R, Hokamp K, Roche FM, Mu R, Doho GH, Pistolic J, Powers JP, Bryan J, Brinkman FS, Hancock RE. Modulation of the TLR-mediated inflammatory response by the endogenous human host defense peptide LL-37. J Immunol. 2006, 176(4), 2455-64.

[6] Kruidenier L, Kuiper I, Lamers CB, et al. Intestinal oxidative damage in inflammatory bowel disease: semi-quantification, localization, and association with mucosal antioxidants. J Pathol. 2003, 201, 28Y36.

[7] Han W, Mercenier A, Ait-Belgnaoui A, Pavan S, Lamine F, van Swam II, Kleerebezem M, Salvador-Cartier C, Hisbergues M, Bueno L, Theodorou V, Fioramonti J. Improvement of an experimental colitis in rats by lactic acid bacteria producing superoxide dismutase. Inflamm Bowel Dis. 2006, 12(11), 1044-52.

[8] Akyol, I., Comlekcioglu, U., Karakas, A. et al. Regulation of the acid induciblercfB promoter inLactococcus lactis subsp.lactis . Ann. Microbiol. 2008, 58, 269.