Hematopoietic stem/progenitor cells (HSPC) modification

From Wiki FKKT

Jump to: navigation, search

Gensko spreminjanje HIV-1 koreceptorja CCR5 v hematopoetskih in progenitorskh celicah odraslih z uporabo ZFN

Povzeto po: Genomic Editing of the HIV-1 Coreceptor CCR5 in Adult Hematipoietic Stem and Progenitor Cells Using Zinc Finger Nucleases, L Li, L Krymskaya, J Wang, J Henley et al; Molecular Therapy v 21/6, 1259–1269; junij 2013


UVOD

HIV virus predstavlja enega izmed največjih zdravstvenih problemov po svetu. Leta 2010 je bilo po svetu okuženih okrog 34 milijonov ljudi Kljub velikemu napredku, kako izboljšati kvaliteto življenja obolelih z antiretrovirusno terapijo pa trenutno ne moremo AIDS-a popolnoma pozdraviti oz. uničiti virus HIV-1 v telesu. Leta 2009 so Huetter s sodelavci opisali prvi primer pacienta, ki je obolel za AIDS-om in akutno mieloidno levkemijo in. Iz nekega donorja so v okviru zdravljenja prenesli v omenjenega pacienta prenesli kostni mozek. Lastnost tega donorja pa je bila, da je imel 32-bp dolgo delecijo na CCR5 genu, kar se odraža v nefunkcionalnem proteinu. 2 leti po transplantaciji v pacientu niso zaznali HIV-1 virusa. Ker je bil to primer ozdravitve za AIDS-om, so se znanstveniki želeli opredeliti potencialno zdravljenje, ki cilja CCR5. V omenjenem članku so želeli z virusnim vektorjem mutirati gen za CCR5 v HSPC (hematopoetske matične in progenitorske celice) preveriti kakšnem učinek ima to na AIDS.

EKSPERIMENTALNI DEL

V poskusu je bil uporabljen vadenovirusni vektor Ad5/F35, ki kodira zapis za ZFN (zinc-finger nuclease). Za delovanje sta potrebna 2 ZFN proteina, vsak vsebuje 4 motive cinkovega prsta. Vsak cinkov prst prepozna 6 bp, zato ZFN prepozna 24-bp dolgo zapordje, ki ga tudi cepi. ZFN proteina uporabljena v tem poskusu sta povezana preko 2A peptidne sekvence. Cepi ga domena, ki izhaja iz FokI endonukleaze. Ko je dvojna vijačnica popravljena pride do NHEJ, ki pa je v določenih primerih nenatančno zato pride do izgube funkcije gena. V našem primeru ZFN cepi gen na tisti lokaciji, kjer kodira prvi transmembransko vijačnico in do transkripcije ne pride. HSPC uporabljene v tem poskusu so bile izolirali iz periferne krvi s pomočjo granulocitnega-CSF, ki sproži izločanje HSPC iz kostnega mozga v kri. HSPC so nato transfecirali z adenovirusim, ki izraža CCR5-ZFN. S surveyor nukleaznim testom so določili, v kolikšni meri so bili geni za CCR5 mutirani in sicer je test pokazal, da mutiranih genov ni bilo več kot 5%. Ko so celice izpostavljene PMA (forbol 12-miristat 13-acetat) ali briostatinu-1 se poveča učinkovitost transdukcije, delež mutiranih genov, se pa zato zmanjša preživetje celic. Obe molekuli delujeta kot aktivatorja PKC. Ugotovili so tudi, da aktivacija PKC deluje tako, da ojača ERK/MAPK signalno pot. Preverili so tudi, kako se mutacija ohranja v posameznih linijah celic. 7 dni po transduciranju je bilo mutiranih 12-24% celic, po 28. dnevu pa je delež mutiranih celic upadel na 7-18%. Hkrati so s pretočno citometrijo celice po diferenciaciji ločili na monocite, granulocite, ne-mieloidne celice in multipotentne progenitorje ter s surveyor nukleaznim testom ugotovili, da pride do mutacij pri vseh celic, delež mutiranih celic pa ni enak med tipi celic. Do precej velikega deleža mutacij pride pri monocitih (več kot 10%), ki so pomembna tarča HIV-1. V naslednjem poskusu so miši transplantirali s HSPC, ki so bile tranducirane s CCR5-ZFN vektorjem in ki so jih tretirali s PMA ali briostatinom in z netransduciranimi HSPC. Pri transduciranih in s PMA tretiranih celicah je prišlo do sprejetja pri 80-91% miših pri MOI=5 in 50-68% pri MOI=10. Pri istem poskusu, le da so bile celic tretirane z briostatinom, pa je prišlo do približno 2X zmanjšanja sprejetja celic pri MOI=5 in MOI=10. 1 od miši s človeškimi HSPC, ki so bile transfecirane s CCR5-ZFN in tretirane s PMA, je razvila okužbo s podobno kinetiko kot kot kontrolne miši, a se je nivo HIV-1 po 8. tednu močno zmanjšal. Ta miš je imela velik nivo CD45+ in CD4+ celic. Kaj se je ostalo z drugimi miši pa ni omenjeno. Po nekropsiji miši so preverili delež mutiranih CCR5 v celicah kostnega mozga in vranice z surveyor nukleaznim testom. 3% CCR5/ZFN transduciranih in s PMA tretiranih celic v miši je imelo mutiran gen za CCR5 pred infekcijo s HIV-1. 11 tednov po infekciji, je imelo mutiran gen 5% celic v kostnem mozgu in 7% celic v vranici. Se je pa delež mutiranih CD8+ in CD4+ celic povečalo za 20%.

ZAKLJUČEK

Pred to raziskavo so znanstevniki dokazali, da uporaba ZFN uspešno mutira CCR5 gen in da nukleofekcija s plazmidno DNA, ki kodira ZFN tudi uspešno mutira CCR5. V tem poskusu so pokazali, da transdukcija z adenovirusom, ki kodira CCR5-ZFN, povzroči le manjši delež mutiranih genov in je za boljšo učinkovitost potrebe aktivator PKC. Ugotovili so, da je aktivacija PKC povezana z delovanjem ERK/MAPK poti. Če so miši trnasplantiranim s HSPC izpostavili HIV-1, se je delež CCR5 mutiranih CD4+ in CD8+ povečal. Rezultati celotnega eksperimenta nakazujejo na to, da gensko spremenjene HSPC povzročijo rezistentnost teh celic na HIV-1 in vivo. Omenjen mehanizem mutiranja CCR5 bi lahko služil kliničnim poskusom zdravljenja HIV.

VIR Genomic Editing of the HIV-1 Coreceptor CCR5 in Adult Hematopoietic Stem and Progenitor Cells Using Zinc Finger Nucleases Molecular Therapy vol. 21 no. 6, 1259–1269 june 2013

Personal tools