Hkratna karakterizacija več različnih racionalno načrtovanih promotorskih arhitektur

From Wiki FKKT
Jump to navigationJump to search

Povzeto po članku: Yu, T.C., Liu, W.L., Brinck, M.S. et al. Multiplexed characterization of rationally designed promoter architectures deconstructs combinatorial logic for IPTG-inducible systems. Nat Commun 12, 325 (2021). https://doi.org/10.1038/s41467-020-20094-3

Uvod

Ključen korak pri inženiringu bioloških sistemov je zmožnost natančnega uravnavanja genetskega odziva na dražljaje. V primeru inducibilnih promotorjev E. coli nam nepopolno razumevanje odnosa med sestavo zaporedja in izražanja genov ovira zmožnost kontroliranja transkripcijskih dogodkov. Inducibilni promotorji so ključni za celični odgovor na eksogene dejavnike. Delujejo tako, da izvabljajo natančno programirane odzive, zato je želja konstruirati inducibilne promotorje s točno določenimi karakteristikami. Kljub temu, da so bili uporabljeni številni pristopi za konstruiranje inducibilnih promotorjev, pa imajo ti svoje pomanjkljivosti, saj nam ne dajo podatka o tem, kako premestitev vezavnih mest vpliva na izražanje [1].

Analiza transkripcijske aktivnosti regulatornih elementov

Inducibilni promotorji vsebujejo cis-regulatorne elemente, ki delujejo skupaj s številnimi trans-delujočimi faktorji in vplivajo na končni izhodni signal izražanja. Afinitete vezave na operatorska mesta so ključni elementi v določanju aktivnosti represorskega proteina. Represorski mehanizem LacI vključuje zanko, ki nastane iz elementov DNA. Relativni položaj represorskih mest glede na vezavna mesta RNA-polimeraze vpliva na raznolikost represijskih mehanizmov in transkripcijskih obnašanj, pomembna pa je tudi moč promotorja. Prejšnje študije so karakterizirale individualne modularne komponente zaporedja, skupen efekt na indukcijo promotorja pa mora biti še raziskan. Pred kratkim so razvili močno primerljive teste z reporterjem imenovane massively parallel reporter assays (MPRA), ki omogočajo analizo transkripcijske aktivnosti tisočih regulatornih elementov v enem eksperimentu. Z njihovo pomočjo so merili nivoje celične transkripcije večjega števila različic DNA zaporedij [2].

Preučevanje lacZYA promotorja

lacZYA promotor je klasičen model za regulacijo genov v E. coli. Promotor ima dve vezavni mesti za dimer LacI, ki ležita na mestih +11 (proksimalno mesto) in -82 (distalno mesto) glede na mesto začetka transkripcije (TSS), ki obdaja set oz. več različic promotorja z različnima elementoma −10 in −35. Relativna vezavna afiniteta teh elementov odloča o moči promotorja. Ko se LacI veže na obe represorski mesti, se zavira izražanje pod kontrolo nativnega lacZYA promotorja. Kadar je LacI represor vezan le na proksimalno mesto, je vezava RNA-polimeraze na promotor onemogočena, ko pa je vezan le na distalno mesto, do inhibicije transkripcije ne pride. Kadar sta vezani tako proksimalna kot distalna stran proteina, lahko LacI dimeri sodelujejo pri interakcijah homotetramernega proteina. Proksimalna in distalna stran se povežeta skupaj in formirata lokalno DNA zanko. Represijska zanka onemogoči vezavo RNA-polimeraze in zmanjša stopnjo izražanja genov. Izračunamo in izmerimo lahko kako je zanka odvisna od 4 ključnih bioloških parametrov: moči in koncentracije transkripcijskih faktorjev (TF) in od dolžine vmesnih zaporedij med LacI operatorskimi mesti, ki ležijo na različnih medsebojnih razdaljah vzdolž DNA ter zaporedja DNA zanke [3]. Za optimizacijo lacZYA promotorja so validirali vpliv dolžine vmesnih zaporedij med operatorji na inhibicijo transkripcije in preverili, ali tudi ostali represorji sledijo istemu principu [3].

Pri preverjanju odvisnosti med dolžinami vmesnikov in represijo za 6 transkripcijskih faktorjev (TF), so uporabili promotor, ki izhaja iz lacZYA, in sicer lacUV5. Izbrali so TF-je, ki sodelujejo pri nastanku represijske zanke: LacI, AraC, GalR, GlpR, LldR, in PurR. Uporabili so vezavna mesta, o katerih so poročali že v drugih študijah in dizajnirali zaporedja, ki omogočajo tem mestom represijo konstitutivnega promotorja lacUV5. lacUV5 promotor simulira kanonično arhitekturo lacZYA promotorja, vendar ima 2 točkovni mutaciji na elementu −10, saj je tako nivo ekspresije lažje zaznaven. V študiji so proksimalno stran vsakega TF centrirali na mesto +12, s čimer so se izognili prekrivanju z mestom začetka transkripcije. Da bi kvantificirali efekt individualnih mest, so testirali različice, kjer je bila proksimalna ali distalna stran zamenjana z različico naključne sekvence, z enakim deležem GC parov [1].

Najprej so raziskali zmožnost represije lacUV5 promotorja, ko je TF vezan na proksimalnem mestu in primerjali z relativnim izražanjem med različicami, ki so imele na proksimalni strani lacUV5 promotorja naključno preurejeno LacI vezavno mesto. Ugotovili so, da se je represija glede na različice razlikovala med operatorji. Nato so preučevali delovanje represorjev preko vezave na distalno mesto, pri čemer so opazovali, kako se izražanje spreminja v odvisnosti od razdalje od proksimalnega mesta. Ugotovili so, da so od pozicije odvisni efekti značilni za številne TF. Distalna vezavna mesta za GalR, GlpR in PurR variirajo med aktivacijo in represijo, AraC vezavna mesta pa postopoma povečajo represijo, bolj ko se pomikajo navzgor. Da bi videli, ali se ta odnos spremeni, ko je možen nastanek represijske zanke, so evalvirali učinek premikanja distalne strani, ko je bila prisotna tudi proksimalna stran [1].

Uravnavanje moči vezavnih mest

Po identifikaciji optimalnega razmika pri arhitekturi LacI vezavnih mest pri lacUV5, so preučevali možnosti manipulacije, da bi lahko generirali različice lacUV5 z minimalnim puščanjem in maksimalno spremembo zvitja. Z uporabo MPRA strategije so dizajnirali in ustvarili knjižnico 1600 različnih inducibilnih promotorjev, ki so jo poimenovali Pcombo. Medtem ko se O1 operatorsko mesto pojavlja v naravi in ima v naravi najvišjo afiniteto do LacI, pa ima sintetični Osym, ki je simetrična različica, še višjo afiniteto [1].

Najprej so raziskali, kako je sestava sekvenčnih elementov odvisna od neinduciranega izražanja oz. puščanja. Za učinkovito represijo navadno potrebujemo močno operatorsko mesto LacI, kot sta Osym in O1 na proksimalnem mestu. Nato so raziskovali medsebojni vpliv operatorskih mest in kako moč vezavnih mest RNA-polimeraze vpliva na spremembo v stopnji izražanja med induciranim in ne-induciranim stanjem. Promotorji, sestavljeni iz konsenznih mest -10 in -35, so pokazali največjo spremembo v stopnji izražanja, vrednosti pa so bile visoko variabilne in odvisne od sestave operatorskega mesta. Promotorji, ki so vsebovali močne operatorje (O1 in Osym) na proksimalni strani, so imeli spremembo izražanja višjo kot promotorji s šibkimi operatorji. Sprememba pa se je glede na ostale različice zmanjšala, če so Osym parili še z enim Osym na distalni strani. Opazovali so pogoje za optimalno spremembo izražanja z združevanjem eksperimentalnih meritev s pomočjo statističnega mehanskega vezavnega modela. Ustvarili so promotorje, ki vsebujejo različne kombinacije RNA-polimeraze in LacI vezavnih mest. Relativna verjetnost vsakega stanja je podana z e-βE, kjer je E enak vsoti vseh prostih energij za vezavo, ki nastanejo ob vezavi ali nastanku zanke. Z uporabo teh statističnih mehanskih modelov izražanja so dobili vezavne energije vsakega promotorskega elementa in primerjali prilagajanje rezultatov 1493 različnih promotorjev v odsotnosti IPTG. Ugotovili so, da se lahko s tem modelom vsi parametri prilegajo z uporabo le 5 % knjižnice, pri čemer natančno napovejo obnašanje ostalih 95% različic [1].

Nato so gledali, ali lahko dodatno distalno operatorsko mesto izboljša spremembo stopnje izražanja promotorjev. Predvidevali so, da bo povečalo represijo, saj bi se hkrati povečala možnost vezanja represorja in tvorbe zanke. Sintetizirali in testirali so 2000 različic lacUV5 znotraj knjižnice, ki so jo poimenovali Pmultiple in je vsebovala vključek dodatnega modularnega LacI vezavnega mesta (distal+ mesto), ki je ležalo takoj za distalnim vezavnim mestom. Z uporabo MPRA so izmerili ekspresijo 1638 od 2000 različic (81.9%) v odsotnosti IPTG-ja in pri 1 mM IPTG. Opazili so, da lahko močno distal+ operatorsko mesto kompenzira za šibko distalno operatorsko mesto in zmanjša puščanje ter poveča absolutno spremembo nivoja izražanja. Ko je distalno mesto močno, pa dodatek distal+ operatorja zmanjša spremembo nivoja izražanja. V tem primeru se poveča tudi puščanje in inducirano izražanje sistema, kar pomeni, da lahko distal+ mesto inhibira represijo distalnega mesta promotorja [1].

Dodatna operatorska mesta

Raziskovali so tudi, kako premeščanje operatorskih mest vpliva na represijo lacUV5 promotorja. Prejšnja dela so nakazovala, da če so operatorska mesta med -10 in -35 elementi, to omogoča močno represijo. To je položaj operatorja, ki direktno tekmuje z RNA-polimerazo za vezavo. Da bi globje raziskali ta koncept so sintetizirali Pspacer knjižnico, ki vsebuje 4400 variant. Z vsemi testiranimi razdaljami med operatorji, ki so se izkazale za ekvivalentne, so naredili podskupine in analizirali različice z medoperatorsko razdaljo 55 bp, ki naj bi bila dovzetna za tvorbo zank. Da bi ugotovili, kako ta sprememba v arhitekturi vpliva na delovanje promotorjev, so primerjali Pspacer različice s Pcombo promotorji, ki so vključevali iste cis-regulatorne elemente. Promotorji s Pspacer arhitekturo so imeli v povprečju višje stopnje izražanja [1].

Validacija

Na koncu so želeli identificirati še najboljše različice v kanoničnemu lacUV5 promotorju. Iz vseh arhitektur so individualno evalvirali promotorska zaporedja z visoko spremembo nivojev izražanja in z majhnim puščanjem, za kar so uporabili pretočno citometrijo in merili izražanje superzvite oblike GFP v neinduciranih in popolnoma induciranih pogojih. V primerjavi z lacUV5 so kazale vse različice izboljšano spremembo nivoja izražanja [1].

Zaključek

Medtem, ko trenutne strategije za uravnavanje inducibilnih sistemov vključujejo manipuliranje individualnih operatorskih mest in osrednje promotorske elemente, nam ti pristopi dajo le majhen vpogled v kombinatorične interakcije modularnega izražanja. Izmerili so izražanje genov skoraj 9000 različnih promotorskih variant, s čimer so spoznavali logiko dizajniranja številnih arhitektur zaporedij. Ugotovili so, da RNA-polimeraza in represorji tekmujejo za vezavo, in sicer tako, da so promotorji, ki vsebujejo bližnje konsenzne −10 in –35 elemente za vezavo σ70 podenote, funkcionalno ne-represivni, razen če se ujemajo z ustreznim močnim represorskim mestom. Raziskovali so tudi interakcije alternativnega promotorja. Z dinamičnim razponom izražanja glede na arhitekturo alternativnega inducibilnega promotorja lahko bolj natančno uravnavamo metabolne poti. Ta pristop se lahko uporablja tudi za identificiranje pravil oblikovanja, za minimaliziranje puščanja in maksimiranje spremembe nivoja izražanj tudi v ostalih bakterijskih represorskih sistemih, za katere je verjetno, da delujejo po podobnih termodinamskih načelih [1].

Viri

[1] T. C. Yu, W. L. Liu, M. S. Brinck, J. E. Davis, J. Shek, G. Bower, T. Einav, K. D. Insigne, R. Phillips, S. Kosuri, et al.: Multiplexed Characterization of Rationally Designed Promoter Architectures Deconstructs Combinatorial Logic for IPTG-Inducible Systems. Nat. Commun. 2021, 12, 1–14.

[2] T. Ashuach, D. S. Fischer, A. Kreimer, N. Ahituv, F. J. Theis, N. Yosef: MPRAnalyze: Statistical Framework for Massively Parallel Reporter Assays. Genome Biol. 2019, 20, 183.

[3] S. Johnson, M. Lindén, R. Phillips: Sequence Dependence of Transcription Factor-Mediated DNA Looping. Nucleic Acids Res. 2012, 40, 7728–7738.