Inženiring Escherichie coli za selektivno produkcijo geraniola z minimalno endogeno dehidrogenacijo

From Wiki FKKT

Jump to: navigation, search

Geraniol (trans-3,7-dimethil-2,6-oktadien-1-ol; C10H18O) je necikličen monoterpenski alkohol prisoten v rastlinskih eteričnih oljih. Komercialno je pomemben v industriji okusov in dišav, zaradi prijetnega vonja po vrtnicah. Perspektiven je tudi v farmaciji kot zdravilo proti raku in antibiotik ter v agrokemiji kot biopesticid. Geraniol smatrajo tudi za odlično alternativo za bencin, boljšo od etanola, zaradi majhne higroskopnosti, visoke energije in relativno majhne hlapnosti.

Geraniol sintentizira geraniol sintaza iz geranil difosfata (GPP), univerzalnega prekurzorja monoterpenov. GPP sintentizira GPP sintaza (GPPS) s kondenzacijo izopentenil difosfata (IPP) in dimetilalil difosfata (DMAPP), ki sta lahko proizvedena v mevalonatni poti (MVA) ali metileritritol fosfatni (MEP) poti.

Contents

Namen dela

Cilj dela je bil optimizirati proizvodnjo geraniola v dostopnem organizmu kot je E. coli. Do sedaj je bila najvišja proizvodnja geraniola 36,04 mg/L po 48 urah gojenja v S. cerevisiae z mutiranim genom FPPS za večjo proizvodnjo gradnikov geraniola in z dodanim ObGES, ki je geraniol sintaza iz O. basilicum. Koncentracija je bila premajhna za uvedbo v industrijske procese.

Eksperimenti in rezultati

Geraniol je za E. coli zelo toksična spojina, zato so za gojenje uporabili dvofazni sistem s fazo dekana na površini kulture. Dekan se je že v predhodni literaturi uporabljal za učinkovito žetev toksičnih ali hitro hlapljivih terpenoidov iz modificiranih mikroorganizmov in so ga zato uporabili tudi pri produkciji geraniola.

Sprva so ugotavljali kakšen vpliv ima prisotnost oziroma odsotnost geraniol sintaze iz spodnjega dela MVA poti na biosintezo geraniola. Slednji v odsotnosti sintaze nastaja zaradi endogene defosforilacije GPP. Zaradi neznatnih koncentracij so uvedli spodnji del MVA poti in tako zagotovili dovolj gradnikov z IPP in DMAPP, kot substrat so dodajali mevalonat. Dodatno pa so uvedli še GPPS in ObGES (sev GEOLB) in z njunim prekomernim izražanjem in po 36 urah prišli do koncentracije 117 mg/L, ki pa se je v naslednjih 12 urah zmanjšala na 105,2 mg/L. Geraniol se je z izomerizacijo in endogeno dehidrogenacijo pretvarjal v druge geranoide.

V O. basilicum je geraniol dehidrogenacija naravno prisotna. Z BLASTom so v E. coli poiskali encime s čim bolj podobnim AK zaporedjem in našli tri kandidatne gene yjgB, yahK in yddN. Naredili so seve s prekomernim izražanjem teh genov in v gojišče dodajali geraniol. Glede na kontrolni sev so ugotovili, da pri vseh treh pride do pretvorb geraniola že po 10 urah gojenja. Naredili so tudi mutirane seve z deletiranimi geni in za glavni gen odgovoren za endogeni nastenek geranoidov iz geraniola določili gen yjgB.

Naredili so nov sev KGEOLB z izbitim genom yjgB in pričakovali večjo proizvodnjo geraniola ter večjo čistost. Po 48 urah gojenja so dobili 129,7 mg/L, povišala se je tudi čistost iz 78% na 98%. Delecija yjgB gena je povzročila zmanjšano rast celic, vzrok za to še ni znan.

Med eksperimentom so zaradi uvedbe samo spodnje MVA poti morali kot substrat dodajati mevalonat in opazili, da se ga veliko ne porabi (35%). Spodnji del MVA poti so v sevih GEOLB in KGEOLB nadomestili s celotno mevalonatno potjo (seva GEOLW in KGEOLW). Titri vseh geranoidov so bili izjemno visoki: 197,5 mg/L in 187,0 mg/L. Toda pri sevu GEOLW je bila dehidrogenacija 52% v primerjavi s sevom GEOLB (22%). Dehidrogenacija geraniola seva GEOLW (0.43 mg/L/h/OD600) se je izkazala za 3x večjo kot je bila v sevu GEOLB (0.14 mg/L/h/OD600), kar je kazalo da večja produkcija geraniola povzroči tudi hitrejšo dehidrogenacijo v sevu s prisotnim genom yjgB.

Eliminacija gena yjgB je torej ključna za poizvodnjo visokih koncentracij geraniola. Po 48 urah kultivacije so dobili kar 182,5 mg/L.

Zaključki

Raziskava je pokazala, kakšen je inženirski proces za izboljšano proizvodnjo geraniola v E. coli. Endogena dehidrogenacija geraniola je v gostitelju najbolj zavirala uspešno proizvodnjo geraniola, tudi ko so bili gradniki ustrezno priskrbljeni. Preliminarno so odločili kandidatne encime v E. coli, ki bi bili odgovorni za endogeno dehidrogenacijo geraniola glede na podobnost zaporedja med rastlinskimi geraniol dehidrogenazami in proteini E. coli. Z izbitjem glavnega gena yjgB odgovornega za endogeno dehidrogenacijo geraniola in uvedbo učinkovite tuje MVA poti, je bil geraniol proizveden končno do 182,5 mg/L v 48h. To so do sedaj najvišje koncentracije geraniola proizvedenega v modificiranih mikroorganizmih in je približno 5x več od prej poročanih koncentracij 36 mg/L. Pristop uporabljen za selektivno proizvodnjo geraniola z identifikacijo in odstranitvijo endogenih metaboličnih aktivnosti bi bil zlahka uporabljen za rešitev podobnih problemov. Nedavno so uspešno proizvedli l-limonen, še eden monoterpen, do 430 mg/L v modificirani E. coli s heterologno potjo MVA tako, da so skrbno uravnavali biosintezno pot l-limonena. Torej za geraniol pričakujejo, da bodo lahko še bolj uravnali biosintezo geraniola v mutiranem sevu KGEOLW na način kot so to storili na primeru l-limonena.

Članek

Zhou, J., Wang, C., Yoon, S.H., Jang, H.J., Choi, E.S. in Kim, S.W., Engineering Escherichia coli for selective geraniol production with minimized endogenous dehydrogenation. Journal of Biotechnology, 2014, letn. 169, št. 42-50.

Personal tools