Inženirsko pripravljeni promotorji, ki omogočajo izražanje ne glede na število kopij

From Wiki FKKT

Jump to: navigation, search

Povzeto po: T. H. Segall-Shapiro, E. D. Sontag, C. A. Voigt: Engineered Promoters Enable Constant Gene Expression at Any Copy Number in Bacteria. Nat. Biotechnol. 2018, 36, 352–358.

Priprava zanesljivih bioloških delov, za uporabo v genskem inženirstvu je zahtevna. Velik izziv predstavlja časovna konsistentnost konstruktov. Iz teoretičnega vidika je priprava takšnih konstruktov možna z uporabo neusklajene povratne zanke (iFFL). Delovanje povratne zanke je mogoče samo ob pogoju, da je regulacija genov popolnoma nekooperativna. Proces na nivoju proteinov regulirajo efektorji, podobni transkripcijskim aktivatorjem (TALE). Tako pripravljeni promotorji omogočajo konstantno izražanje genov ne glede na njihovo lokacijo na genomu ali plazmidu, uravnavajo izražanje ob spremembah v gojišču, akumulaciji mutacij na genomu, ob prenosu bioloških sistemov iz plazmidnega pa zmanjšajo potrebo po optimizaciji izražanja[1].


Contents

Težave, ki se pojavijo ob pripravi in uporabi bioloških sistemov

Genski inženiring omogoča vstavitev določenega gena v gostiteljsko celico v različnih oblikah. Vnesen biološki sistem se lahko nahaja na plazmidu ali pa ga vstavimo v genom gostitelja. Spremembe v izražanju so posledica faze rasti, spremembe okolja (bioreaktor, zemlja, prebavni trakt), nastanka mutacij. Vsi ti dejavniki pa se pogosto odražajo v številu kopij plazmidne DNA. Pogosto predpostavimo, da je število kopij plazmidne DNA v vseh celicah enako vendar to precej variira med posameznimi celicami. Količina izraženega biološkega sistema genomske DNA variira glede na hitrost delitve celic in bližino mesta začetka replikacije. Pri prenosu določenega konstrukta iz plazmida v genom, ob dodajanju dodatnih bioloških sistemov se prav tako pojavijo velika nihanja v izražanju. Zato je potrebna naknadna optimizacija izražanja. Neoptimalno izražanje bioloških sistemov lahko zaradi kopičenja določenih toksičnih metabolitov povzroči motnje v delovanju gostiteljske celice. Konstruirane metabolne poti zahtevajo določeno količino intermediatov za delovanje, ki jih lahko zagotovimo z variabilnostjo izražanja genov. Uravnavanje izražanja je mogoče na več načinov. Preko regulacije promotorja, kontrole vezave ribosoma, uporabe usmerjene evolucije[2].

Teoretično ozadje

Stabilizirani promotorji vsebujejo biološke dele, ki omogočijo od števila kopij DNA neodvisno izražanje. Stabilizacija zahteva uporabo bioloških delov, ki prepoznajo spremembe v številu kopij in preko tega se regulira aktivnost promotorja, kar lahko dosežemo z uporabo neusklajene povratne zanke (iFFL). Regulacija preko povratnih zank je tudi del naravne regulacije transkripcijskega omrežja in se uporablja v širokem naboru bioloških sistemov. Povratna zanka je nepovezana takrat, ko je vhodni signal ločen od izhodnega in tako pozitivno kot negativno kontrolira izhodni signal[1]. V primeru priprave stabiliziranega promotorja je vhodni signal število kopij, ki enako vplivajo na izražanje vseh promotorjev v celici. Pozitivna regulacija konstuitivnega promotorja je usmerjena tako, da ob povečanju števila kopij DNA pride do povečanja izražanja. Negativno regulacijo pa omogoča proteinski represor, katerega gen se nahaja pod samostojnim promotorjem. Aktivnost promotorja, ki regulira izražanje represorja se poveča ob povečani koncentraciji kopij. Ob povečani aktivnosti pa se sintetizira tudi več represorja, ki blokira transkripcijo DNA. Pod temi pogoji velja, da lahko izražanje gena opišemo z enačbo:

G=c/R^n 

kjer je:

c – število kopij

R – koncentracija represorja

n – kooperativnost vezave

Ker pa je izražanje represorja ni regulirano neposredno lahko predpostavimo, da koncentracija represorja narašča s številom kopij in tako dobimo:

G∝c^(n-1)

Priprava stabiliziranih promotorjev

Za pripravo stabiliziranih promotorjev so bili uporabljeni proteini TALE, ki so primerni predvsem iz vidika tesne interakcije z vezavnim DNA zaporedjem. TALE proteini se vežejo na promotor kot monomeri, kar pomeni, da delujejo enako kot nekooperativna represija. Uporabljeni proteini TALE, so bili že predhodno okarakterizirani, prav tako pa je bila znana lokacija in orientacija promotorske regije v promotorju PT7A1. Gen za protein TALE je bili naknadno prilagojen s tehniko error prone PCR, za izboljšanje interakcije z 18 bp promotorske regije pripravljenega konstrukta, ne pride pa do vezave na genom bakterije E. coli. Gen za sintezo represorjev je pod kontrolo dveh protismernih promotorjev TALEsp1 in TALEsp2, katerih izražanje omogoča od devetdeset pa do dvesto tridesetkratno represijo. Uporaba velike količine različnih regulatornih elementov TALE lahko povzroči oteženo delovanje celice, zato je bila pripravljena serija promotorjev z različnim izražanjem, ki jih kontrolira en sam regulatorni TALE. Izvedene so bile mutacij v promotorju PUPsp1. Tako pripravljeni promotorji imajo različno afiniteto za vezavo represorja TALE in posledično različno moč regulacije izražanja GOI. Vsi pripravljeni promotorji so bili še vedno sposobni enakomernega izražanja ne glede na število kopij[1].

Karakterizacija pripravljenih stabiliziranih promotorjev

Okarakteriziran je bil efekt števila kopij na izoliran konstuitiven promotor (PT7A1w1) preko vstavitve v knjižnico plazmidov pSC101 v razponu različnega števila kopij. Ti plazmidi so skoraj identični, razlika je le v tem, da se v nekaterih mestih začetka replikacije pojavljajo mutacije, ki porušijo regulacijo števila kopij. Tekom eksponentne rasti se število kopij tega plazmida giblje med 3 in 100 na celico, ekspresija pa variira za dvajsetkrat glede na prisotnost[1].

Sledila je uporaba biološkega sistema s promotorjem TALEsp1 in njegova karakterizacija s knjižnico plazmidov pSC101. Regulacijski elementi represorja TALE so omogočili zadovoljivo izražanje. Tako je bila omogočeno primerna vezava represorja za identifikacijo aktivnosti tekom visoke ekspresije GOI. Stabiliziran promotor je omogočal uravnoteženje izražanja ne glede na uporabljen plazmid. Populacijska krivulja, ki so jo identificirali s pomočjo citometrije je pokazala, da se je porazdelitev izražanja v populaciji spremenila v eno samo krivuljo[1].


Stabiliziran promotor je bil nato testiran v različnih plazmidih, izbranih je bilo pet najpogosteje uporabljenih elementov, ki označujejo mesto začetka replikacije: incW, pSC101, p15A, ColE1 in pUC. Podobno kot pSC101 jih velika večina variira v številu kopij na celico (2-38 tekom eksponentne rasti). Variirajo pa tudi v velikosti in izražanju genov, ter lokaciji v celici, kjer se nahajajo[3]. Ob uporabi konstuitivnega promotorja je izražanje variiralo za šestnajstkrat, medtem ko so bili stabilizirani promotorji sposobni eliminirati veliko večino nihanja v izražanju[1].

Aplikacija stabiliziranih promotorjev

1. Regulacija izražanja DNA s pomočjo stabiliziranih promotorjev

Količina izražene DNA se spreminja tudi glede na hitrost delitve celic. Sposobnost promotorja TALEsp2, da izniči ta učinek ob povečani delitvi celic je bil testiran preko izražanja zelenega fluorescirajočega proteina (GFP). Gen za GFP je bil ustavljen pod stabiliziran promotor, celoten biološki sistem pa so nato vgradili v genom s pomočjo sistema Tn5. Pripravljenih je bilo 35 sevov, v katerih se je reporterski gen nahajal na različnih lokacijah v genomu. Lokacija konstrukta je bila določena z arbitrarnim PCR, proces pa je bil ponovljen z izoliranimi promotorji divjega tipa za pripravo primerjalnih sevov. Pričakovano je knjižnica konstuitivnih promotorjev divjega tipa pokazala največje izražanje pri tistih konstruktih, ki so bili vgrajeni najbližje mesta začetka replikacije, medtem, ko je knjižnica s stabiliziranimi promotorji prikazovala neodvisnost od mesta nahajanja konstrukta na genomu[1].

2. Uporaba stabiliziranih promotorjev na primeru sintezne poti deoksikromoviridana

Časovna neobstojnost plazmidov v gostiteljski celici pogosto predstavlja problem v biotehnologiji, zato se poslužujemo prenosa bioloških sistemov iz plazmidnega ogrodja, (kjer je priprava veliko enostavnejša), na genom gostiteljske celice. Prenos bioloških sistemov, ki imajo vgrajene stabilizirane promotorje, je bil testiran na sintezni poti deoksikromoviridana. Sintezna pot te spojine je zapisana na enem operonu, in jo sestavljajo trije encimi. Za potrebe optimalne sinteze produktov je potrebna specifična količina izraženih genov. Za kontrolo sistema je bila pripravljena knjižnica z različno kombinacijo vezavnih mest za ribosom, preko katerih je bilo kontrolirano izražanje intermediatov. Ob uporabi promotorja divjega tipa se je regulacija na nivoju vezavnega mesta za ribosom porušila. Če pa je bilo izražanje DNA regulirano na nivoju transkripcije preko stabiliziranega promotorja TALEsp2 je sistem deloval učinkovito. Količina intermediatov je bila ustrezno regulirana. Prav tako pa ob prenosu na genom bakterije ni bila potrebna dodatna optimizacija izražanja[1].

3. Vpliv mutacij na replikacijo

Mutacije v genomu lahko vplivajo na replikacijski sistem plazmida. Testirali so vstavitve gena za toksičen produkt na plazmidnem ogrodju v celico, čemur je sledila uvedba mutacij na genom in štetje zraslih celic. Tam kjer je zraslo večje število celic je mutacija na genomu vplivala na zmanjšano sintezo toksičnega protukta[4]. V tem primeru je bil preverjen učinek stabiliziranih promotorjev na odpravo šuma zaradi nastalih mutacij. Z vstavitvijo stabiliziranega promotorja pred okvarjen gen pcnB, ki je odgovoren za število kopij plazmida v celici na principu RNA regulacije. Učinek mutacije v pcnB se ob tem izniči. Količina izraženega gena je bila enaka, kot če okvare v genu ne bi bilo. Takšen način stabilizacije omogoča povečanje evolucijske robustnosti [1].

Literatura

[1]T. H. Segall-Shapiro, E. D. Sontag, C. A. Voigt: Engineered Promoters Enable Constant Gene Expression at Any Copy Number in Bacteria. Nat. Biotechnol. 2018, 36, 352–358.

[2]D. H. S. Block, R. Hussein, L. W. Liang, H. N. Lim: Regulatory Consequences of Gene Translocation in Bacteria. Nucleic Acids Res. 2012, 40, 8979–8992.

[3]T. Q. Ho, Z. Zhong, S. Aung, J. Pogliano: Compatible Bacterial Plasmids Are Targeted to Independent Cellular Locations in Escherichia Coli. EMBO J. 2002, 21, 1864–1872.

[4]J. Fernandez-Rodriguez, L. Yang, T. E. Gorochowski, D. B. Gordon, C. A. Voigt: Memory and Combinatorial Logic Based on DNA Inversions: Dynamics and Evolutionary Stability. ACS Synth. Biol. 2015, 4, 1361–1372.

Personal tools