Inhibicija vezave humanega norovirusa na naravni receptor z biotehnološko proizvedenimi fukoziliranimi oligosaharidi

From Wiki FKKT
Jump to navigationJump to search

Norovirusi so vzrok za približno milijon hudih oblik akutnega gastroenteritisa. V velikem merilu so, s pomočjo E. coli, proizvedli lakto-N-fukopentozo (LNFP I), enega izmed humanih mlečnih oligosaharidov (HMO), ki negativno vpliva na vezavo norovirusov na antigene krvnih skupin (angl. histo-blood group antigen, HBGA).

NOROVIRUSI IN VEZAVA NA HUMANE RECEPTORJE

Norovirusi sodijo v družino Caliciviridae, za katere je značilna ikozaedrična kapsida brez ovojnice ter pozitivno usmerjena ssRNA. Genom je organiziran v tri odprte bralne okvirje (ORF), ki zapisujejo proteine kapside. V ORF2 je zapisana glavna strukturna beljakovina VP1, ki ima N-končno S (angl. shell – lupina) domeno in tvori ikozaedrično sredico kapside, ter C-kočno P (angl. protrusion – prodirajoča) domeno, ki deluje kot epitop in sodeluje v vezavi na receptor. ORF3 zapisuje manjšo strukturno beljakovino VP2. Noroviruse delimo v šest genomskih skupin, od GI do GVI, ki povzročajo akutne gastroenteritise pri vseh starostnih skupinah [1].

Norovirusi prepoznajo HBGA kot receptorje za vstop v celice [2]. HBGA so na površini črevesnih celic, najdemo pa jih tudi raztopljene v krvi, želodčnem soku in materinem mleku. Gen FUT2 zapisuje α1,2-fukoziltransferazo, ki katalizira reakcijo vezave fukoze na terminalno galaktozo prekurzorja za H-antigen. Glede ne terminalni ogljikov hidrat na H-antigenu, ki je vezan na glikoprotein oz. glikolipid, delimo HBGA na tip A (N-acetilgalaktozamin) in tip B (galaktoza) [3].

Na interakcije med HBGA in norovirusom negativno vplivajo HMO, ki so po strukturi podobni HBGA, zato se norovirusi vežejo nanje. Prav tako, kot HBGA, tudi HMO naravno najdemo v materinem mleku, kar služi kot zaščita novorojenčkov pred norovirusi in posledično diarejo. Poznamo več različnih HMO: 2'-fukozillaktoza (2'FL), lakto-N-fukopentoza I (LNFP I), difuzillakto-N-heksoza (DFLNH), idr. Vsak HMO ima različno afiniteto do različnega genotipa. LNFP I na primer izkazuje visoko afiniteto do GII.4 Sydney.

PROIZVODNJA LNFP I

Za proizvodnjo in sekrecijo LNFP I so uporabili genetsko modificirano E. coli BL21(DE3), s katero so pridobili proizvodni sev. V genom slednjega so integrirali gene, potrebne za proizvodnjo LNFP I, hkrati pa so deaktivirali oziroma delatirali gene, ki sodelujejo v metabolnih poteh, ki bi motile proizvodnjo LNFP I. Vsi vstavljeni geni so bili pod kontrolo konstituivnega promotorja.

Za razgradnjo stranskih produktov in neželenih saharidov proizvodnje LNFP I, so prav tako genetsko modificirali E. coli BL21(DE3), da so pridobili razgradni sev. Le-ta ima sposobnost razgradnje laktoze do galaktoze in glukoze ter lakto-N-triozo II (LNT II) do laktoze ali N-acetilglukozamina (GlcNAc).

Proizvodna in razgradna seva so gojili na ločenih gojiščih z dodatkom mineralni soli in glukoze, ki je vir ogljika, brez antibiotika, pri temperaturi 30°C in pH 7. Fermentacija je potekala v treh fazah: faza eksponentne rasti, dohranjevalna faza in faza razgradnje stranskih produktov. 25 L predhodno pripravljene kulture proizvodnega seva so prenesli v fermentator s 700 L enakega gojišča, kateremu so dodajali glukozo do želene optične gostote (OD600nm = 5). Nato so začeli dodajati laktozo, ki je substrat za sintezo lakto-N-tetroze (LNT), do končne koncentracije 5 mM. Pri OD600nm = 20, se je porabila vsa zaloga glukoze. Tako se je začela dohranjevalna faza, dodajanje glukoze in vzdrževanje nasičenosti kisika v fermentacijski juhi. Po 7 urah so v fermentacijski juhi s pomočjo HPLC zasledili prisotnost LNT II, LNT in LNFP I. Po 52 urah so zaustavili fermentacijo z dodatkom razgradnega seva, prav tako pa so prenehali dodajati vir ogljika, da je razgradni sev kot vir ogljika uporabil LNT II in laktozo. V nadaljnjih korakih so očistili LNFP I, prisotnost pa so potrdili z masno spektroskopijo. Sledila je encimska pretvorba očiščenega LNFP I v HBGA tipa A1 in B1 z rekombinantno pripravljanjema encimoma, GTA in GTB (glikoziltransferaza A ali B).

S površinsko plazmonsko resonanco (SPR) so določili zmožnost inhibicije virusnih delcev na površino čipa, ki je prekrit s krvno-skupinskimi antigeni, trisaharidi A (TriA) ali trisaharidi B (TriB). Kot inhibitorje so uporabili fukozo, LNFP I, HBGA B1, HBGA A1, itd. Iz eksperimentov, kjer so uporabili različno koncentracijo inhibitorja, so lahko določili srednjo inhibitorno koncetracijo (IC50). Z metodo ELISA so določali zmožnost laktoze, fukoze in HMO (LNT, 2'FL, LNFP I), da inhibirajo vezavo norovirusov, genotipa GII.17 in GII.4, na mucin iz humane amnijske tekočine ali želodčnega soka.

ZAKLJUČEK

V članku so dokazali zmožnost priprave kompleksnih fukoziliranih HMO v velikem merilu, prav tako pa so dokazali, da je kombinacija fukoziliranih HMO, tako kompleksnih kot preprostih, uspešna pri preprečevanju infekcij z norovirusi, torej bodo lahko fukozilirani HMO služili kot profilaktični ali terapevtski antivirotiki.

LITERATURA

[1] S. M. Derya et al., “Biotechnologically produced fucosylated oligosaccharides inhibit the binding of human noroviruses to their natural receptors,” J. Biotechnol., vol. 318, no. April, pp. 31–38, 2020, doi: 10.1016/j.jbiotec.2020.05.001.

[2] M. Tan and X. Jiang, “Histo-blood group antigens: A common niche for norovirus and rotavirus,” Expert Rev. Mol. Med., vol. 16, no. March, 2014, doi: 10.1017/erm.2014.2.

[3] J. Nordgren and L. Svensson, “Genetic susceptibility to human norovirus infection: An update,” Viruses, vol. 11, no. 3, pp. 1–19, 2019, doi: 10.3390/v11030226.