Izboljšane mišje inducirane pluripotentne celice

From Wiki FKKT

Jump to: navigation, search

Contents

Uvod v raziskavo

Leta 2006 je skupini profesorja Shinya Yamanaka iz Univerze v Kyotu na Japonskem prvič uspelo inducirati pluripotentne matične celice (iPS) iz somatskih celic. Te celice so bile po morfologiji, proliferaciji in formaciji teratomov podobne embrionalnim (ES), a so se od njih razlikovale v ekspresiji genov in metilaciji DNA, hkrati pa se iz njih niso razvile odrasle himere. Prav tako je bil odstotek somatskih celic, ki so postale iPS, zelo majhen. Leto dni kasneje sta ta ista skupina in skupina znanstvenikov iz Harvarda in MIT ločeno objavili rezultate raziskav, s katerimi so poskušali izboljšati iPS celice. Predvidevali so, da bi bila za nepopolno reprogramiranje lahko kriva izbira selekcijskega markerja Fbx15. Tako so za novega kandidata izbrali Nanog. Oba, Fbx15 in Nanog, sta tarči Oct3/4 in Sox2, vendar lahko Nanog še bolj tesno povežemo s pluripotenco. Rezultati raziskav so namreč pokazali, da če pri miši zmotimo izražanje Nanog, le-ta izgubi pluripotentni epiblast, medtem ko to ne velja za Fbx15. Z raziskavo, ki je opisana v nadaljevanju, so tako ustvarili Nanog iPS celice in jih primerjali z ES. Osredotočili so se na metilacijo, gensko ekspresijo in razvoj odraslih himer.

Kvalitativno ovrednotenje iPS celic

Napredek, ki ga omogoča uporaba iPS celic v medicini, sloni predvsem na karakteristikah iPS celic. Glavni cilj raziskav iz leta 2007 je bilo opredeljevanje morfoloških in metilacijskih značilnosti celic pred, med in po reprogramiranju. Kvaliteta produciranih iPS celic in s tem uspešnost reprogramiranja sta odvisni od tega, kako dobro smo ponaredili lastnosti embrionalnih matičnih celic. Specifični markerji, s katerimi znanstveniki opredelijo uspešnost reprogramiranja, so SSEA1, alkalna fosfataza in Nanog. Prisotnost teh markerjev je značilnost ES celic in pomaga določiti v kolikšni meri je potekel omenjeni proces. Natančno beleženje lastnosti celic med reprogramiranjem in sočasna primerjava z ES pa omogoča primerjavo različnih tipov iPS. Kriterijev za ovrednotenje kvalitete iPS celic je več, najpomembnejše lastnosti, ki predstavljajo merilo za kvaliteto celic, pa so:

  • razvojni potencial iPS celic,
  • učinkovitost pridobivanja celic iz embrionalnih celičnih linij (determinira jo zmožnost aktivacije endogena),
  • morfološka podobnost s kolonijami embrionalnih matičnih celic,
  • toleriranje globalne demetilacije v aktiviranih endogenih ter
  • stabilnost iPS celic.

Razvojni potencial iPS celic

Razvojni potencial iPS celic je opredeljen kot sposobnost tvorbe teratomov in himer pri injiciranju v blastociste. Na ta način lahko raziskovalci testirajo razvojno zmogljivost iPS. Manifestacija v živih embrijih potrjuje razvojno zmogljivost testiranih iPS. Posebej občutljiv preizkus za zmogljivost predstavlja injiciranje iPS v tetramerne blastociste.

Stabilnost pluripotentnih celic

Kaj stabilizira pluripotentno stanje? Ugotovljeno je bilo, da med reprogramiranjem pride do globalne demetilacije, za katero so odgovorne DNA metiltransferaze (Dnmt1). Ti encimi vplivajo na kompaktiranost kromatina in s tem na utišanje genov. Tako se utišajo tudi virusno kodirani transkripcijski faktorji, ki so sprožili sam proces reprogramiranja. Ugotovitev je bila podprta z eksperimentom, kjer so z deaktivacijo Dnmt1 v »knockdown«  iPS zvišali nivo virusnih transkriptov za Sox2, Oct4 in Klf4. Edini transkripcijki faktor, ki ni bil občutljiv na demetilacijo je c-myc, katerega uporaba pa ni zaželjena, saj povečuje verjetnost za nastanek tumorjev. Pluripotentno stanje torej ne more biti vzdrževano z geni na virusnem vektorju, ker se ta med reprogramiranjem v iPS celice zaradi delovanja DNA metiltransferaz utiša. Virusno kodirani transkripcijski faktorji le inducirajo diferenciacijo v iPS celice, nato pa se med reprogramiranjem zaradi genomske demetilacije utišajo. Najvažnejša endogena pri vzpostavljanju pluripotentnosti sta Nanog in Oct4, saj se izražata tudi po demetilaciji. Oba sta v iPS celicah hipometilirana, enako velja za ES celice. Hipometilacija je posledica globalne demetilacije, ki se zgodi med reprogramiranjem, eksperimentalno pa so jo dokazali z utišanjem gena za metiltransferazo. Valu demetilacije med reprogramiranjem sledi ponovna remetilacija, ki pa jo iPS celice tolerirajo. To nesporno kaže na podobnosti med iPS in ES celicami, saj je toleriranje demetilacije značilnost, ki iPS in ES celice ločuje od somatskih, ki tega ne zmorejo.

Nanog iPS celice

Nanog iPS celice so se v različnih raziskavah pokazale za zelo obetajoče, saj so epigenetsko skoraj identične ES celicam. Njihova pomanjkljivost je nizka učinkovitost indukcije, ki je manj kot 0,1%. Zadnje raziskave v povezavi z Nanog iPS celicami so bolj spodbudne. Izdatna ekspresija Nanoga v zadnjem koraku reprogramiranja naj bi nekoliko izboljšala izkoristek tega procesa. V povezavi z izboljšanjem reprogramiranja se omenjata še dva kromatinska remodelirna kompleksa BAF in CHD1. Prvi olajša vezavo Oct4 na promotor pluripotentnega gena, drugi pa je pomemben za vzdrževanje odprte konformacije kromatina v embrionalnih matičnih celicah. Dodatno izražanje Nanoga vpliva na demetilacijske agente DNA. Ti remodelirajo represivne histonske ostanke, ki zakrivajo vezavna mesta za transkripcijske faktorje na promotorjih pluripotentnih genov. Tranzicija v iPS celice je ojačana tudi zato, ker Nanog interagira s transkripcijskimi faktorji in olajša vezavo le-teh na promotorska mesta. Ekspresija Nanog gena se je izkazala kot ključna pri vzpostavljanju pluripotentnega stanja. Ta gen preprečuje spontano diferenciacijo ES celic in vpliva na stabilnost iPS celic. Slabost Nanog iPS celic je dolg podvojevalni čas in s tem zamudno pridobivanje. Pri klinični aplikaciji teh celic bi morali izključiti c-myc, ki spodbuja nastanek tumorjev.

Primerjava Nanog-iPS in Oct4-iPS

Oct4 iPS celice so pripravili tako, da so v fibroblaste vstavili vektor, ki vsebuje že omenjene štiri transkripcijske faktorje, ki so potrebni za induciranje v pluripotentno stanje, ter aktivirali endogen Oct4. Obema linijama je skupna nizka učinkovitost pridobivanja iz MEF, ki je bila 0,05-0,1%. Oct4-iPS celice je bilo težje pridobiti kot Nanog, saj so tvorile od 3 do 10x manj kolonij kot Nanog. To je znak, da je lažje aktivirati Nanog lokus. Nanog iPS so tvorile trikrat več kolonij podobnih ES. Kolonije so bile homogene in stabilne. Na podlagi ekspresije SSEA1, alkalne fosfataze in Nanoga v inficiranih MEF so zaključili, da je reprogramiranje počasen proces. Z bisulfitnim sekvencioniranjem in kombinirano bisulfitno restrikcijsko analizo (COBRA) so raziskali metilacijske vzorce promotorjev Nanog in Oct4 v iPS, ES ter MEFs. Rezultati, ki jih daje slednja analiza povedo delež metiliranih oziroma demetiliranih CpG otočkov. V splošnem je metilacija CpG otočkov je povezana z utišanjem genov, kar je posledica večje kompaktiranosti kromatina in s tem otežene transkripcije. Dokazano je bilo, da metilirani otočki vežejo histonske deacetilaze in ostale faktorje, ki so vpleteni v transkripcijo in utišanje.

Analiza COBRA je pokazala, da sta oba promotorja Oct4 in Nanog v somatskih celicah reprimirana. Pri reprogramiranju v iPS celice je prišlo do demetilacije CpG otočkov, kar je znak aktivacije obeh genov v iPS. Aktivnost Oct4 in Nanoga je bila pokazana tudi v ES celicah, kar pomeni, da sta Nanog in Oct4 pomembna endogena pri vzpostavljanju pluripotentnosti. Hipometiliranost obeh endogenov v iPS in v ES nakazuje na proces demetilacije in uspešno reprogramiranje.

Primerjava Nanog in Fbx15 iPS celic

Za opazovanje izboljšanja Nanog iPS celic v primerjavi s Fbx15 iPS celicami je bilo potrebno pripraviti še slednje. Pri tem so po virusni uvedbi štirih transkripcijskih faktorjev v celico selektivno izbrali ekspresijo gena Fbx15. Prva stvar, ki so jo opazili, je bila večja ekspresija celičnih markerjev za ES celice v Nanog iPS celicah. Prav tako so v njih našli več izraženih genov, ki jih sicer najdemo v ES celicah, kar potrjuje, da so Nanog iPS celice po genski ekspresiji bolj podobne ES celicam kot Fbx15 iPS celice. Stabilnost obeh tipov iPS celic so nato primerjali z gojenjem v prisotnosti selekcijskega markerja in izvedli več pasaž. Morfološke razlike niso bile opazne, zmanjšalo pa se je število ES markerskih genov pri Fbx15 iPS celicah, kar dokazuje večjo stabilnost Nanog iPS celic. Nasprotno so pri primerjanju stopnje ekspresije štirih transgenov dokazali višji nivo ekspresije pri Fbx15 iPS celicah. Ker pa je analiza Southern blot pokazala podobno število retrovirusne integracije v obeh vrstah celic, se domneva, da je retrovirusna ekspresija transgenov v Nanog iPS celicah utišana, kar je značilno tudi za ES celice. Nanog iPS celice so ES celicam bolj podobne tudi v metilacijskih vzorcih. Promotorske regije Nanoga, Oct3/4 in Fbx15 so bile namreč zelo demetilirane v Nanog-iPS celicah, kar pa ne velja za Fbx15-iPS celice, ki so imele te iste promotorje le delno demetilirane. Večja podobnost Nanog iPS celic se kaže še v odgovorih na LIF in retinojsko kislino. Pri prvem se nediferencirano stanje celic vzdržuje, pri drugem pa se diferenciacija inducira, kar drži tudi za ES celice in nasprotuje Fbx15 iPS celicam. Izboljšanost Nanog iPS celic v primerjavi s Fbx15 iPS celicami potrjuje tudi dejstvo, da so sposobne tvoriti žive himere.

Diskusija

V raziskavah so dokazali, da štirje transkripcijski faktorji (Oct4, Sox2, c-myc in Klf4) res lahko inducirajo reprogramiranje somatskih celic v inducirano pluripotento stanje. Selekcija za aktivacijo Oct4 v primerjavi s Fbx15 izboljša podobnost ES celicam, medtem ko pa Nanog omogoča še bolj kvalitetne inducirane pluripotentne celice. Te so epigenetsko identične ES celicam po številnih kriterijih: sposobne so tvoriti žive himere in teratome, imajo podobno morfologijo, proliferativnost ter metilacijske vzorce. Pluripotento stanje je inducirano z virusno transduciranimi faktorji, medtem ko je vzdrževano z aktivnostjo endogenih pluripotentnih faktorjev, kot sta Oct4 in Nanog. To potrjuje dejstvo, da postaneta ta gena hipometilirana tako v iPS celicah kot v ES celicah. V obravnavanih raziskavah so imele skoraj vse Nanog iPS celice enake lastnosti kot ES celice, kar kaže na to, da je Nanog glavna determinanta kvalitete v celični proliferaciji. Kljub temu pa najverjetneje obstajajo tudi druge pomembne determinante, saj je bila uspešnost reproduktivne zmožnosti variabilna. Zaradi visoke kvalitete Nanog iPS celic se kaže možnost uporabe te tehnologije za generiranje pacient-specifičnih pluripotentnih celic. Težava je edino v tem, da lahko ponovna aktivacija c-myc retrovirusa vodi v razvoj tumorja. Rešitve se kažejo v najdbi majhnih molekul, ki bi dosegle reprogramiranje brez genskega prenosa in potencialno škodljivih genov, saj ti, kot že rečeno, ne skrbijo za vzdrževanje pluripotentnosti. Retrovirusno reguliran sistem bi lahko nadomestili s prehodno ekspresijo, kot je npr. adenovirusno reguliran sistem. Vse te raziskave dokazujejo, da obstajajo možnosti za izboljšanje iPS celic, ki bi jih lahko varno uporabili v regenerativni medicini, a le brez uporabe retrovirusov.


Viri

Personal tools