Kloniranje miši iz iPSC

From Wiki FKKT

Jump to: navigation, search

Contents

Uvod

Odrasle diferencirane celice lahko z uporabo majhnega števila določenih transkripcijskih faktorjev reprogramiramo oz. spremenimo v inducirane pluripotentne matične celice (iPS celice), ki so v marsičem podobne embrionalnim matičnim celicam (ES celice). Z iPS celicami bi bilo možno zdraviti različne degenerativne in genetske bolezni, nadomeščati poškodovana tkiva, uporabne bi bile kot modeli za raziskave bolezni, pri vsem tem pa ne bi prišlo do etično sporne uporabe embrionalnih celic. Vendar pa imajo iPSC tudi določene slabosti; v nekaterih raziskavah so se izkazale za tumorigene in nagnjene k hitrejšemu celičnemu staranju.

Pojavljalo pa se je tudi vprašanje o njihovi pluripotentnosti, saj je to ena od bistvenih značilnosti matičnih celic. Pluripotentne matične celice prispevajo k razvoju vseh treh zarodnih plasti (endoderma, mezoderma in ektoderma) in so se tako sposobne razviti v vse celice zarodka, ne morejo pa tvoriti izvenembrionalnih tkiv.

ES celice so se izkazale kot bolj učikovite pri kloniranju. V naslednjih raziskavah se poroča o uspehih kloniranja živih miši iz reprogramiranih fibroblastov, kar kaže na to, da so lahko vse značilnosti stopnje pluripotentosti nadomeščene brez izpostavljanja neznanim ooplazemskim faktorjem. Primerjanje teh polno pluripotentnih iPS celičnih linij bo lahko pokazalo molekulske markerje potrebne za pluripotentna stanja.

Preverjanje pluripotentnosti z genetskimi in celičnimi analizami

Genetske izboljšave (1. primer)

V prvem primeru so se najprej lotili načrtovanja genetske oznake za razlikovanje izvora celic iz blastociste ali iPS celic. Mišje embriontske fibroblaste se je pridobilo s križanjem dveh mišjih trangenih linij (Pchd21/Cre ter Z/EG).

  • Z/EG linija vsebuje v večini celici viden ter selektiven marker ß-GEO (fuzija gena za ß-galaktozidazo ter gena za rezistenco na neomicin; tu pride lahko do detekcije aktivnega encime ß-galaktozidaze preko X-galaktoze, kjer se tvori modro obarvan produkt, ali pa se kot selekcijski marker uporabi odpornost klonov proti neomicinu; v raziskavi se je uporabil prvi marker).
  • Pchd21/Cre linija; promotor protokadherina 21(katerega ekspresija je značilna predvsem za dva tipa nevronov pri vohalnem sistemu v glomerulu) podpira ekspresijo Cre rekombinaze (je specifična rekombinaza, ki katalizira specifično rekombinacijo na točno določenem mestu v DNA).

Tako je prišlo pri kombiniranju celičnih linij pri sveh tipih vohalnih nevronov miši, zaradi delovanja Cre rekombinaze do izreza »floksiranega« ß-geo gena, kar pa je kot za posledico imelo izražanje GFP (zelenega fluoscirajočega proteina).

Nepravilno izražanje reprogramirajočih genov skozi razvoj bi lahko inhibiral embionalni in poporodni razvoj. Odločili so se za tesno kontrolo trangene ekspresije v iPS celicah. Štiri »Yamanaka« faktorje (Oct4, Klf4, Sox2 in Myc-c) so prenesli v celice preko retrovirusa ter ih postavili pod okrilje tetO promotorja (prepis pod tem promotorjem se inducira v prisotnosti antibiotika tetraciklina ali njegovih derivatov (npr. doksiciklina)). V našem sistemu je sistem aktiviran preko izboljšane verzije reverznega tetraciklin transaktivatorja (rtTAM2.2), v prisotnosti doksiciklina. Da bi se vpodbudila še večja učinkovitost reprogramiranja in izolacija popolno reprogramiranih iPS celic so izpostavili mišje embironalne fibroblaste valproični kislini, za katero se je izkazalo, da poveča reprogramsko učinkovitost in inhibicira nepopolnoma reprogramiranih celic z inhibicijo njihovih celičnih delitev.

Pridobivanje celičnih linij (1. primer)

Z reprogramiranjem Pcdh21/cre-Z/EG fibroblastov se je po 5 dneh v prisotnosti doksiciklina in VPA ter po 7 dneh le v prisotnosti doksiciklina razvilo 21 celičnih linij, označenih z oznakami iMZ1-21. Ker univerzalnega testa za ugotavljanje pluripotetnosti še ni, so izvedli vrsto testiranj, na podlagi katerih so izbrali celične linije primerne za test tetraploidne komplementacije.

Glede na morfologijo oz. nenormalno širjenje so zavrgli 9 celičnih linij, ostalih 15 pa testirali z imonofluorescenco za ekspresijo markerjev za pluripotentnost (Sox2, Oct4). Vse linije so vsebovale izražene markerje prav tako so se iz vseh razvila embrionalna telesa, pri katerih so testirali sposobnost tvorbe mišjih vohalnih nevronov. Celične linije so razdelili v 2 skupini: tiste, ki so razvile veliko število mišjih vohalnih nevronov: celične linije iMZ2, iMZ10, iMZ12, iMZ13, iMZ18, iMZ11, iMZ14, iMZ17, iMZ20 in iMZ21 ter skupino celičnih linij, ki so razvile malo vohalnih nevronov: iMZ3, iMZ15, iMZ7, iMZ9. V nadaljnjih testiranjih so linije primerjali s kontrolno skupino embrionalnih celic z imunooznačevanjem treh pluripotentnih markerjev za:

Nanog, ki je transkripcijski faktor za Rex1 promotor ter je ključnega pomena za ohranjanje pluripotentnosti (Rex1 je prav tako eden izmed markerjev za pluripotentnost, njegova količina močno upade ob začetku diferenciacije celic)

Oct4, ta transkripcijski faktor je aktiven predvsem v oocitih, ostaja pa prisoten tudi v embriih. Pojavlja se tudi v nediferenciranih celicah tumorjev, utišanje njegovega gena pa pripelje do diferenciacije celic.

SSEA-1: ob začetku diferenciacije celic se izražanje SSEA-1 gena močno poveča, antigene za SSEA-1 oz. drugače imenovanemu tudi CD15 najdemo v zarodnih oz. embrionalnih celicah glodavcev ter njihovih rakavih celicah.

Na podlagi teh markerjev so ugotavljali podrobnosti z embrionalnimi celicami ter izbrali 7 celičnih linij, ki so se v podobnosti ujemale z embrionalnimi celicami in posledično razlikovale od fibroblastov iz katerih so reprogramirali iPS celice. 4 od 7 celičnih linij so razvile veliko mišjih vohalnih nevronov (iMZ9, iMZ11, iMZ14, iMZ17 in iMZ21). To skupino ter skupino linij, ki so bile pozitivne na vse pluripotentne markerje, vendar so razvile relativno nizko število vohalnih nevronov so izbrali za nadaljnje analize kariotipa. Štiri od osmih linij so bile euploidne (iMZ9, iMZ11, iMZ15 in iMZ21) ter tako primerne za uporabo v testu tetraploidne komplementacije.

Celične in genetske analize (1. primer)

Preko detekcije ß-galaktozidaze v mišjih tkivih (obarvanje celic iz celičnih linij in negativni rezultat pri celicah blastocist), PCR tehnike za detekcijo mikrosatelitnih markerjev in PCR tehnike za ugotavljanje prisotnosti albino (donor blastociste je albino osebek) mutacije na Tyr genu so dokazali, da konstitucija celic v mišjih osebkih izhaja izključno iz celice celičnih linij in so se vsa tkiva razvila izključno iz pluripotentnih celic. Southern blot analiza za Oct4 in rtTAM2.2 je pokazala vzorec provirusne integracije, ki je identična vzorcem integracije iz iPS celičnih linij. Nobena do sedaj znana ES celična linija ne vsebuje dane genetske modfikacije, kar kaže na to, da ni prišlo do kontaminacije z nobeno prej obstajajočo ES celično linijo. Kvantitativna PCR z reverzno transkripcijo (qRT-PCR) je pokazala skoraj popolno utišanost provirusnih transgenov pri iPSC celicah v odsotnosti doksicilkina. Celične linije so se ponovno tretirale z doksiciklinom. Iz celičnih linij, iz katerih je izšlo večina iPS miši je v odsotnosti doksiciklina bila prisotna reducirana ekspresija vseh 4ih reprogamirajočih faktorjev. Medtem ko je pri manj uspešnih linijah prišlo do zaznavne detekcije ekspresije Oct4 in /ali Klf4; kar kaže na nepopolno reprogramiranje manj uspešnih celičnih linij. Specifičnost sistema se je potrdila tudi z imunoflorescenčno analizo nevronov za percepcijo vonja, ki je kazala pozitivno bravanje za ß-galaktozidazo razen dveh tipov nevronov kjer je bila prisotna ekspresija GFP.

Mnogo izboljšav je lahko odgovornih za dano pluripotentnost celičnih linij. 1.) Visoka stopnja indukcije transgena preko rtTAM2.2 in daljši čas ekspresije reprogramijajočih faktorjev kot navadno (več časa za bolj popolno reprogramiranje) 2.) Reguliranje ekspresije našega transgena preko doksiciklina, kar je pomagalo preprečiti nepravilno ekspresijo reprogramijajočih faktorjev skozi embrionalni razvoj 3.) Daljša terapija z valproično kislino je lahko omogočila reprogramiranje epigenoma v stanje kromatina bolj podobnemu tistemu v ES celicah

Genetske izboljšave (2. primer)

V drugem primeru so mišje embrionalne fibroblaste ki odražajo Oct4 z GFP okužili (preko retrovirusa) z “Yamanaka” faktorji. Druga modifikacija je vključevala zamenjavo seruma v katerem se celice gojijo s fetalnim govejim serumom.

Pridobivanje celičnih linij (2. primer)

Na gojiščih na katerih so gojili mišje embrionalne fibroblaste, v katere so prenesli "Yamanaka faktorje", so po 10 dneh zaznali večjo količino alkalne fosfataze, katere povišana količina se pojavlja v membrani pluripotentih celic ter med drugim služi kot test pluripotentonost. Prav tako so zaznali zeleni fluorescirajoči protein (GPF), ki je kazal na prisotnost Oct4 (katerega količina upade ob začetku diferenciacije celic).

Celice so iz gojišča odvzeli po 14 dneh, (celične linije IP14D), 20 dneh (celične linije IP20D) in 36 dneh (celične linije IP36D) ter na tak način pridobili 31 stabilnih, diploentnih celičnih linij s 40 kromosomi.

Test z bisulfidnim skevenciranjem je v treh od pridobljenih celičnih linij (IP20D-3, IP36D-3 ter IP14D-1) pokazal podoben metilacijski vzorec kot vzorec kontrolne skupine embrionalnih celic, h krati pa se je močno razlikoval od mišjih embrionalnih fibroblastov, iz katerih so z reprogramiranjem pridobili zgoraj omenjene pluripotentne celične linije. Pluripotentnost teh linij so dokazali tudi z vnosom le teh v miši s hudo kombinirano imunsko pomanjkljivostjo pri katerih se je razvil teratom z vsemi tremi zarodnimi plastmi.

Za nadaljnjo testiranje pluripotentnosti so naključno izbrali celične linije ter jih vključili v normalno CD-1 blastocisto ter jo prenesli v CD-1 samico miši, ter opazovali razvoj embriov do mladičev. Rezultati so pokazali da celične linije IP36D in IP20D razvijejo žive miši z 5-80% himernostjo, linije IP14D pa miši z 10-95% himernostjo. Kloniranje miši s tetraploidno komplementacijo ni bilo enako uspešno pri vseh celičnih linijah, iz celičnih linij IP36D so se sicer razvili embrii, ki pa so v 10. dnevu razvoja umrli. Celične linije IP20D prav tako niso razvile živih mladičev oz. embriov starejših od 17 dni, med tem ko se je iz celičnih linij IP14D razvilo tudi do 22 živih mladičev. Rezultati celične linije IP14D-1 so bili celo primerljivi z rezultati kontrolne skupine z embrionalnimi celicami (v obeh primerih se je razvilo približno 3% živih mladičev).

Celične in genetske analize (2. primer)

Bisulfitno sekveniranje pa je pokazalo demetilacijo na Nanog in Oct4 promotorjih v induciranih celičnih linijah, v primerjavi z originalnimi fibroblasti, ki kažejo veliko večjo metiliranosti. Se pa vzorec pogostosti metiliranja sovpada s tistim iz ES celic – kar kaže na potek epigenetskega reprogramiranja. Povečana stopnja demetilacije najverjetneje kaže na povečano stopnjo transkripcije pluripotentnih markerjev. Z uporabo PCR tehnike unikatnih mikrosatelitov se je dokazal izvor celic iz miši, ki je izključno iz pluripotentnih celičnih linij. Z kvantitativno reverzno PCR tehniko se je tudi tu dokazovala ekspresija štirih reprogramijajočih faktorjev. Analiza preko mikročipov je pokazala, da je ekspresija pluripotentnih markerjev podobna med iPS celicami in ES celicami, se pa izključuje z izvornimi fibroblastnimi celicami.

Našemu sistemu zagotavljanja pluripotentnosti so bile dovedene genetske izboljšave. Na podlagi ugotavljanja epigenetskega statusa pluripotentnih celic iz celičnih linij, izražanju specifičnih pluripotentnih markerjev, dokazovanju izvora celic, specifičnosti sistema ter stopnje reprogramiranja so se dokazale številne izboljšave ter podprle polni pluripotentni status iPS celic.

Preverjanje funkcionalne in razvojne pluripotentnosti

Funkcionalna pluripotentnost

Z določenimi metodami se preverja sposobnost diferenciacije celic v vse tri zarodne plasti, kar nakazuje na velik diferenciacijski potencial.

Te raziskave lahko potekajo in vitro, ena takih je oblikovanje embrioidnih teles. To so tridimenzionalni agregati matičnih celic, ki se spontano oblikujejo v suspenziji. Z njihovo pomočjo se oceni sposobnost diferenciacije in razvoja v vse tri zarodne plasti, vendar pa ne nakazujejo na izoblikovanje celic v strukture in tkiva.

Pogosto se uporablja in vivo metoda, pri kateri se tvori teratom. Pri tem testu v miš, ki trpi za hudo kombinirano imunsko pomanjkljivostjo (okvarjeni so limfociti T in B), injiciramo preiskovane iPS celice. Če so le-te pluripotentne, se razvijejo v teratom; tumor, ki vsebuje različne celice vseh treh zarodnih plasti.

Razvojna pluripotentnost

To je najvišja raven pluripotentnosti, s katero se preverja sposobnost razvoja iPS celic v vse celične tipe odraslega organizma, vključno s spolnimi celicami.

Ena od pogosto uporabljenih metod je tvorba himer. Himere so organizmi, ki so sestavljeni iz vsaj dveh vrst genetsko različnih celic in nastanejo pri spojitvi celic iz vsaj dveh zarodkov. Za namene raziskav iPS celic se himerne miši pripravijo z agregacijo preiskovanih matičnih celic z embrijem v 8-celičnem stadiju ali injiciranjem matičnih celic v blastocisto. Ta se nato prenese v mišjo samico, ki povrže himerne mladiče. Ti so glede na genetsko sestavo nekakšna mešanica obeh vrst uporabljenih celic. Injicirane matične celice prispevajo le k razvoju zarodka, ne pa tudi k nastanku izvenembrionalnih tkiv (placente). V obravnavanih raziskavah so za pripravo iPS celic uporabili embrionalne fibroblaste iz miši s črnim kožuhom, nato pa so iPS celice injicirali v blastocisto albino miši. Rojeni mladiči so imeli značilen lisast kožuh (črne in bele barve).

Za najstrožji in najzahtevnejši test dokazovanja pluripotentnosti velja test tetraploidne komplementacije. Z uporabo električnega toka poteče pfuzija dveh zarodkov v 2-celičnem stadiju in tako nastane tetraploidna blastocista, iz katere se lahko diferencirajo izvenembrionalna tkiva, ne more pa se razviti zarodek. Šele z vnosom diploidnih matičnih celic v tetraploidno blastocisto omogočimo normalen razvoj zarodka, katerega celice izhajajo izključno iz injiciranih matičnih celic, placenta pa iz tetraploidnih celic. V raziskavah je tetraploidna blastocista izhajala iz albino miši, prav take vrste pa je bila tudi samica, v katero so vsadili tetraploidno celico z vnesenimi iPS celicami. Dobljene miši so bile izključno rjave barve, tako kot tiste, iz katerih so izolirali embrionalne fibroblaste za pripravo iPS celic, kar potrjuje, da celice organizma izhajajo le iz vnesenih iPS celic.

Po uspešni tvorbi himer in tetraploidni komplementaciji se dobljene mišje samce pari s samicami. Z metodo prenosa genskega materiala se preverja, ali lahko iPS celice prispevajo tudi k razvoju funkcionalnih spolnih celic, ki so odgovorne za nastanek viabilnih potomcev.

Odstotek viabilnosti in uspešnosti kloniranja

Odstotek preživelih v prvih uspešnih poskusih kloniranja miši iz induciranih pluripotentnih celic variira od 0,3% do 13% (odvisno od celične linije). Uspešnost kloniranja je podobna uspešni tetraploidne komplementacije z ES celicami ter SCNT-ES metodi. Večina preživelih osebkov ni kazala morfoloških defektov. Pri umrlih osebkih pa so se tipično kazale težave z dihanjem, ki je pogosta v tetraploidni komplementaciji z ES celicami. Kloniranje je pogosto kazalo morfološke abnormalnosti kot so težave pri dihanju, neonatalna prekomerna velikost ter splošno velik odstotek smrtnosti in neuspešnosti. Največji razlog se gotovo skriva v nepopolnem reprogramiranju celic uporabljenih za kloniranje in nepravilnim epigenetskim profilom. Samo področje je slabo raziskano. Študije so kljub temu pokazale da neonatalno prekomerno velikost povzroča tehnika kloniranja prenosa jedra (SCNT metoda). Prav tako so pokazale, da je povečana abnormalnost pri dihanju in večja smrtnost prisotna pri osebkih z nižjo stopnjo heterozigotnosti.

Zaključek

Zaenkrat še ni znan univerzalen set označevalcev, ki bi nakazoval na popolno pluripotentnost iPS celic. Tetraploidna komplementacija zato ostaja najbolj primeren test za ocenjevanje sposobnosti iPS celic za razvoj v vse celične linije nekega organizma. Z uspešno pomnoženimi mišimi s testom tetraploidne komplementacije so dokazali, da je z direktnim reprogramiranjem s 4 faktorji možno ustvariti iPS celice, ki so funkcionalno primerljive z embrionalnimi celicami. Dokazana pa je tudi ”uspešnost” metode tetraploidne komplementacije z iPS celicami za pridobivanje odraslih miši iz diferenciranih celic.

Še vedno pa ni povsem jasno, kaj povzroča razlike v pluripotentnosti med iPS celičnimi linijami. Raziskovalci domnevajo, da so za to odgovorne specifične značilnosti reprogramiranih celičnih linij. V prihodnosti bi bilo potrebno nameniti pozornost tudi delno reprogramiranim in manj pluripotentnim celičnim linijam, ki ne ustvarijo viabilnih miši pri testu tetraploidne komplementacije (zadoščajo pa katerim drugim kriterijem pluripotentnosti), saj bi z njihovim preučevanjem lahko odkrili razlike in mehanizme reprogramiranja na molekularni ravni.

Viri

  • Boland M.J. in sod. Adult mice generated from induced pluripotent stem cells. Nature, 2009, številka 461, str. 91-94
  • Kang L. in Gao S. Pluripotency of induced pluripotent stem cells. Journal of animal science and biotechnology, 2012, letnik 3, številka 5.
  • Smith K.P. in sod. Pluripotency: Toward a Gold Standard for Human ES and iPS Cells. Journal of Cell Physiology, 2009, številka 220, str. 21-29
  • Stadtfeld M. in sod. Induced pluripotency: history, mechanisms, and applications. Genes Dev., 2010, letn. 24, str. 2239-2263.
  • Zhao X.Y. in sod. iPS cells produce viable mice through tetraploid complementation. Nature, 2009, številka 461, str. 86-90
Personal tools