Kombinatorični pristopi pri načrtovanju medproteinskih interakcij, uravnavanih s svetlobnimi stikali
Medproteinske interakcije
Medproteinske interakcije, med katere spadajo tudi dvokomponentni dimerizacijski sistemi, so ena ključnih točk za regulacijo celične signalizacije, izražanja genov in metabolizma. Interakcije med proteini lahko kontroliramo s pomočjo kemikalij (CID – chemically-induced dimerization) ali svetlobe (LID -light induced dimerization). Nekatere učinkovine so lahko toksične za celice ali pa jih je potrebno v celice vnesti s pomočjo kompleksnih transportnih sistemov. V tem oziru je indukcija s svetlobo enostavnejša [1]. Naravni dimerizacijski sistemi so pogosto kompleksni in se na aktivacijski signal ne odzivajo dovolj specifično. Pogosto imajo rezidualno aktivnost tudi v neaktivni obliki, po indukciji pa se ne odzovejo z dovoljšno intenzivnostjo. Primernejše je de novo načrtovanje dimerizacijskih sistemov, pri katerem poiščemo par fotoreceptorja in vezavnega partnerja, ki v naravi sicer ne interagirata. Učinkovita je metoda COMBINES-LID, pri kateri iz kombinatorične knjižnice izberemo protein, ki bo ustrezal potrebam našega dimerizacijskega sistema. Dimerizacijski partner mora prepoznati s svetlobo inducirano konformacijsko spremembo na fotoreceptorju. Konformacija fotoreceptorjev je pogosto funkcijsko pogojena in nestabilna, zato na primer ne moremo z aktivirano obliko receptorja enostavno imunizirati živali in dobiti ustreznih protiteles. V ta namen sintetiziramo kombinatorično knjižnico, v kateri so proteini z imunoglobulinskim, neimunoglobulinskim ali de novo ustvarjenim proteinskim ogrodjem in naključno spremenjenimi vezavnimi mesti ali površinami. Knjižnico nato izrazimo, in vitro predstavimo na fagih ali ribosomih ter selekcioniramo. Poznamo več tipov medproteinskih interakcij, na osnovi katerih lahko delujejo svetlobna stikala [1, 2].
Tipi svetlobnih stikal
Heterodimerizacijska svetlobna stikala
Najenostavnejši princip delovanja svetlobnega stikala za dimerizacijo je heterodimerizacija fotoreceptorja in dimerizacijskega partnerja, ki se s tem aktivira in deluje na tarčni protein. Pogosti fotoreceptorji so fitokromi, kriptokromi in sistemi za zaznavanje napetosti LOV (light-oxygen-voltage). Po obsevanju s svetlobo se spremeni konformacija fotoreceptorja, kar omogoči vezavo dimerizacijskega partnerja. Fotoreceptorju lahko spreminjamo parametre kot so intenzivnost in valovna dolžina aktivacijske svetlobe, specifičnost in afiniteta do dimerizacijskega partnerja ter kinetika in reverzibilnost vezave. Običajno absorbirajo svetlobo nekje med bližnjim infrardečim in ultravijoličnim delom spektra. Naravni fotosistemi imajo pogosto dodatne domene, ki ne sodelujejo pri signaliziranju s svetlobo, lahko pa povzročajo neželene interference. Velikost gena za večdomenski protein je lahko problematična pri vnosu zapisa v celice, sploh v sesalskih celicah pa se pogosto takšen konstrukt težje izraža. Rešitev je lahko odstranitev celotnih proteinskih domen, kar pa lahko vpliva na stabilnost in funkcionalnost fotoreceptorja. Pri de novo načrtovanju heterodimerizacijskega sistema iz kombinatorične knjižnice s pozitivno in negativno selekcijo izberemo proteine, ki se vežejo bodisi na aktivno bodisi na neaktivno obliko fotoreceptorja. Izbrane proteine lahko nato tudi dodatno optimiziramo. Načrtovanja kombinatoričnih knjižnic fotoreceptorjev se poslužujemo redkeje, saj mutacije pogosto negativno vplivajo na funkcionalnost receptorjev.
Proteini z izbirno vezavo (opto-binders)
Drug primer svetlobnih stikal so t. i. proteini z izbirno vezavo (opto-binders), ki se običajno vežejo na nemodificirane endogene proteine. Izhajajo iz naravnih vezavnih partnerjev tarčnih proteinov (npr. protiteles). Aktivirajo se lahko s komplementacijo proteinskih fragmentov, pri kateri se fragmenta vezavnega proteina po obsevanju s svetlobo sestavita v funkcionalno enoto. Druga možnost je, da svetloba povzroči konformacijsko spremembo, ki alosterično vpliva na vezavno mesto. Alosterično regulirani proteini z izbirno vezavo so sestavljeni le iz ene podenote, zato je potrebno uvesti le en genski zapis, kar pomeni enostavnejše uravnavanje izražanja. Problem je načrtovanje takšnih proteinov za poljubne tarče v celici. Postopki so dolgotrajni, dragi in pogosto manj uspešni, saj moramo fotoreceptor in vezavnega partnerja povezati v funkcionalen alosterično reguliran himerni protein. Pri načrtovanju proteinov z izbirno vezavo običajno v ogrodje vezavnega proteina vstavimo fotosenzorično domeno. To pogosto privede do napak, saj nova domena moti ali spremeni vezavo na tarčo. Tudi za selekcijo proteinov z izbirno vezavo bi lahko uporabili metodo COMBINES-LID, vendar se poraja vprašanje, ali tovrstni sistemi pri predstavitvi na površini ohranijo funkcionalnost [1].
To je sistem, pri katerem namesto fotoreceptorja svetloba sprosti ali aktivira učinkovino, ki se nato veže na t. i. proteinsko sidro in omogoči njegovo dimerizacijo s funkcijskim proteinom. Sistem lahko temelji na nemodificiranih endogenih sidrnih proteinih in vezavnih partnerjih. Učinkovine so običajno male molekule z na svetlobo občutljivo funkcionalno skupino. Na tem delu male molekule lahko svetloba povzroči cepitev (npr. v derivatih kumarina in 2-nitrobenzena) ali fotoizomerizacijo (npr. v derivatih azobenzena). Regulacija takih sistemov lahko poteka na treh stopnjah: pri aktivaciji učinkovine s svetlobo, vezavi učinkovine na proteinsko sidro in pri dimerizaciji sidra s svojim partnerjem. Selekcija ustreznih komponent dimerizacijskega sistema poteka v dveh korakih. Najprej se iz knjižnice malih molekul izbere ligand, ki se po aktivaciji s svetlobo ustrezno veže na proteinsko sidro. Sledi iskanje dimerizacijskega partnerja, ki se lahko veže na z ligandom aktivirano proteinsko sidro. V obeh stopnjah izvedemo pozitivno in negativno selekcijo. V tem primeru se uporablja metoda COMBINES-CID [1, 2].
Primer: sistem nanoReD
Sistem nanoReD omogoča specifično in reverzibilno dimerizacijo, inducirano z rdečo svetlobo. Deluje na osnovi heterodimerizacije. Fotoreceptor v tem sistemu je bakterijski fitokrom DrBphP, nanj pa se veže specifično protitelo. Aktivacijska svetloba ima valovno dolžino 654 nm, inaktivacijska svetloba pa 775 nm. Tkivo prepušča svetlobo z valovno dolžino od 650 nm do 900 nm, zato lahko sistem in vivo uporabimo za kontrolo celičnih procesov v globlje ležečih tkivih. Sistem je bil načrtovan de novo, ustrezni komponenti pa sta bili izbrani s pomočjo metode COMBINES-LID [3].
1. Izbira fotoreceptorja: DrBphP je bakterijski fitokrom, ki kot kromofor uporablja biliverdin. Ta je prisoten tudi v sesalskih celicah, zato eksogena administracija ni potrebna. V sistemu so uporabili skrajšano obliko fotoreceptorja, kar pa ni vplivalo na njegovo aktivnost. Dodatno so proteinu dodali tudi biotinsko oznako, ki je omogočila pritrjevanje prek avidina.
2. Selekcija nanoprotiteles: Nanoprotitelesa so enodomenska protitelesa, velika 12 do 15 kDa, ki imajo enotno ogrodje in tri variabilne komplementarnost določujoče regije. Uporabili so kombinatorično knjižnico nanoprotiteles, ustvarjeno s pomočjo tehnologije trinukleotidne mutageneze [4]. Nanoprotitelesa so predstavili na površini fagov in jih selekcionirali. Prvo stopnjo je predstavljala negativna selekcija, pri kateri so na kolono so prek biotina imobilizirali temotno obliko DrBphP (obsevano z inaktivacijsko svetlobo). Protitelesa, ki so se vezala na to obliko so izločili, ostala so le tista z nizko ali ničelno afiniteto do temotne oblike. V drugi stopnji so izvedli pozitivno selekcijo, kjer so se nenoprotitelesa vezala na kolono s svetlobno obliko DrBphP (obsevano z aktivacijsko svetlobo). Ta protitelesa so iz kolone eluirali z obsevanjem z inaktivacijsko svetlobo. Po štirih ciklih tovrstne selekcije so dobili podknjižnico specifičnih nanoprotiteles, ki so sposobna reverzibilne vezave.
3. Dvohibridni sistem kvasovk: Z dvohibridnim sistemom kvasovk so ugotovili, katera nanoprotitelesa iz podknjižnice se lahko izražajo v citoplazmi in ohranijo specifičnost vezave. Sev kvasovk Y2HGold so kotransficirali z dvema plazmidoma, na enem je bil zapis za fotoreceptor DrBphP, na drugem pa zapis za nanoprotitelo. Ta sev kvasovk ima zapise za 4 encime, ki komplementirajo okvarjene poti biosinteze aminokislin, izražajo pa se le pod pogojem, da preiskovana proteina dimerizirata. Proteina dimerizirata le, ko ju obsevamo s svetlobo, zato so za nadaljnje študije izbrali kolonije kvasovk, ki so zrastle na ustreznem selekcijskem gojišču po obsevanju z aktivacijsko svetlobo. Na tak način so določili 5 variant nanoprotiteles, katerih specifičnost in reverzibilnost vezave so dodatno potrdili še z ELISO.
4. Validacija v sesalskih celicah: Za določanje aktivnosti in vivo so dimerizacijski sistem vnesli v dvohibridni sistem sesalskih celic. V celično linijo HEK 293T so vnesli zapisa za fuzijo DrBphP in N-končne DNA-vezavne domene GAL4 ter nanoprotitelesa s C-končno domeno transkripcijskega aktivatorja p65. Tak sistem je omogočil s svetlobo regulirano izražanje luciferaze. V celicah, ki so jih gojili v temi ali pa obsevali z inaktivacijsko svetlobo, aktivnosti reporterskega proteina niso zaznali, v celicah, obsevanih z aktivatorno svetlobo, pa se je luciferaza izražala. Pozitiven rezultat so dobili pri dveh od petih variant nanoprotiteles, z naknadnimi analizami pa so ugotovili, da se ostale tri variante fragmentirajo in očitno niso primerne za izražanje v tem tipu gostiteljskih celic. Največjo vrednost je signal reporterskega proteina dosegel po 24 urah in je bil približno 19-krat višji kot signal negativne kontrole in temotne oblike sistema.
5. Validacija v živih organizmih: Preverjanje delovanja sistema so izvedli v golih miših, ki so jim transformirane celice HEK 293T subkutano injicirali ali pa jih transplantirali v jetra. Po obsevanju z aktivatorno svetlobo se je po 24 urah bioluminiscenca celic v obeh primerih povečala 25- do 30-krat. S tem so dokazali, da sistem deluje tudi v živih organizmih, svetloba pri valovni dolžini 654 nm pa lahko prodre tudi v globlje plasti tkiva [3].
Zaključek
Načrtovanje sistemov iz poljubnih kombinacij stikal in aktuatorjev predstavlja širok nabor funkcij, ki jih taki sistemi lahko opravljajo. Kombinatorične metode nam omogočajo učinkovito in relativno enostavno določanje interakcijskih partnerjev s primerno občutljivostjo in specifičnostjo. Neinvazivna regulacija medproteinskih interakcij s svetlobo ima velik aplikativni potencial v biomedicini, na primer časovno in prostorsko specifična aktivacija imunskih celic za zdravljenje tumorjev.
Viri
[1] X. Zhang, Y. Pan, S. Kang, L. Gu: Combinatorial Approaches for Efficient Design of Photoswitchable Protein-Protein Interactions as In Vivo Actuators. Front. Bioeng. Biotechnol. 2022, 10(February), str. 1–7.
[2] S. Kang, K. Davidsen, L. Gomez-castillo, H. Jiang, X. Fu, Z. Li, Y. Liang, M. Jahn, M. Moussa, … L. Gu: COMBINES-CID: An Efficient Method for De Novo Engineering of Highly Specific Chemically Induced Protein Dimerization Systems. J. Am. Chem. Soc. 2019, 141, str. 10948–10952.
[3] Z. Huang, Z. Li, X. Zhang, S. Kang, R. Dong, L. Sun, X. Fu, D. Vaisar, K. Watanabe, L. Gu: Creating Red Light-Switchable Protein Dimerization Systems as Genetically Encoded Actuators with High Specificity. ACS Synth. Biol. 2020, 9(12), str. 3322–3333.
[4] B. Virnekas, L. Ge, A. Plukthun, K. C. Schneider, G. Wellnhofer, S. E. Moroney: Trinucleotide phosphoramidites: Ideal reagents for the synthesis of mixed oligonucleotides for random mutagenesis. Nucleic Acids Res. 1994, 22(25), str. 5600–5607.
