Kratki predogled kemijske sintezne biologije

From Wiki FKKT

Jump to: navigation, search

Uvod Po navadi sinteza biologija bazira na manipuliranju z genomom, medtem ko kemijska sintezna biologija (KSB) (ang. chemical synthetic biology, CSB), uporablja in sestavlja biološke dele, ki so ali niso sintetični, da ustvarimo novo in alternativno strukturo. KSB, je veja sintezna biologije, ki je usmerjena v sintezo alternativnih kemičnih struktur, ki so prisotne v naravi. Kemijska sintezna biologija v praksi kombinira biologijo in inženirstvo z namenom, da dobi sintezno biološke strukture (proteine, nukleinske kisline, XNA, PNA, vezikle) ali oblike življenja, ki niso prisotna v naravi. Hkrati pa ustvarimo nadzor nad njihovimi predvidljivimi genetsko-metabolnimi potmi. V članku je velik del posvečen predstavitvi in komentiranju dveh glavnih projektov v KSB: - »Nikoli rojeni biopolimeri«: projekt se spopada z konstrukcijo in presajanjem RNA in peptidnih sekvenc, ki niso prisotne v naravi.

»Minimalna celica« se osredotoča na konstrukcijo pol-sintetičnih celic. Te celice so po navadi sestavljene iz liposomov, ki vsebujejo minimalno, a zadostno, število komponent, da lahko opravljajo osnovne funkcije biološke celice. KSB lahko sestavlja nove biološke strukture na dva načina: iz že obstoječih osnovnih gradnikov ali iz osnovnih gradnikov, ki niso prisotni v naravi (npr. XNA- sinteza genetskih polimerov, ki predstavljajo zmožnost dedovanja in evolucije). KSB išče odgovore in razlage za:

- temeljito razumevanje biološke funkcije in organizacije organizmov, oz. zakaj je narava naredila tako in zakaj ne drugače (zakaj se uporabljajo ravno ribsomi, nukleinske kisline…). Odgovore na ta vprašanja dobimo, tako da v laboratoriju nekaj naključno naredimo in nato primerjamo z že obstoječim.

- enako kot SB, vendar ima lahko ogromen vpliv na biotehnologijo, generiranje aplikacij za nanomedicino, diagnosticiranje, tarčna zdravila, bioinženirstvo, biosenzoriko itd., z umetno zasnovanimi molekulami.


Nikoli rojeni biopolimeri (NBB) Projekt NNB se ukvarja s vprašanjem, zakaj in kako to, da obstoječi proteini in RNA strukture tako močno izstopajo in so se ohranile skozi evolucijo. Z osnovnim vprašanjem, ali imajo nekaj zelo posebnega v svoji strukturi ali z vidika termodinamike (zvitje proteinov). Ideja o NBB se giba od opazovanja, da obstaja nabor proteinov in RNA molekul, ki so le trenutno prisotne v živih organizmih in so le manjši del od vseh teoretičnih možnih sekvenc. Število vseh možnih peptidov iz 50 aminokislinskih ostankov, če jih sintetiziramo iz 20 naravno prisotnih aminokislin, lahko dobimo 2050 različnih peptidov. Število, ki podaja razliko med vsemi potencialno možno obstoječimi proteini in dejansko prisotnimi proteini v živih organizmih je enako, kot če primerjamo zrno peska z zrni v Sahari. Na osnovi opazovanja, se nam poraja vprašanje, ali je funkcionalnost skupna značilnost ali redki rezultat naravne selekcije. To je izjemnega pomena za pojasnitev vloge biopolimerov pri izvoru življenja in da se v celoti izkoristi biološki potencial biopolimerov.


Nikoli rojeni proteini (NBP) Da bi sploh lahko obstajali proteini, aminokislinske verige, morajo zadoščati pogoju, da so stabilni. Razumljivo je sklepati, da so naravni proteini imeli priložnost se selekcionirat med ogromno različnimi variantami, med zelo podobnimi spojinami. Nastali so kot ena varianta, izmed ogromno možnostmi, in so bili sposobni spodbujati celično življenje. Pristop vključuje »totalno naključje«, kjer ni v naprej podanih nobenih osnov za strukturne ali funkcionalne lastnosti. Ravno to vodi v nujno nastajanje popolno novih proteinov, ki niso prisotni v naravi- NBP. Eksperimentalni postopek za doseganje cilja je razvit tako, da so zviti polipeptidi (nastali kratki peptidi) bolj zaščiteni pred razgradnjo s proteazo, kakor razviti. Prve poskuse za združevanje produktov v knjižnice, s selekcijo zvitih proteinov s pomočjo proteolize, sta zasnovala Kristensen in Winter. Originalnost postopka leži v sami knjižnici, ki je bila ustvarjena z »de novo« popolno naključnimi zaporedji AK. Knjižnica je sestavljena iz proteinov, ki niso prisotni v naravi in zajema specifične kratke fiksne sekvence, ki so nastale s popolno naključno polipeptidno sekvenco. NBP selekcijska metoda povezuje proteolitično odpornost s selektivno obnovljivostjo, ki je koristna za pridobivanje novih zvitih proteinov. Dobimo potrditev, da naključno selekcijski zviti proteini obstajajo, da je zvijanje proteinov splošna značilnost relativno dolgih polipeptidnih verig. Uporaba binarnega vzorca (polarne/nepolarne) aminokisline ali podskupine aminokislin (levcin, glutamin in arginin)) za konstrukcijo »de novo« knjižnice s stabilno 3D strukturo je zelo perspektivna. To pa omogoča selekcijo proteinov z zaželeno karakterizacijo.


Nikoli rojene RNA (NBRNA) Na podoben način, kot je opisano raziskovanje NBP je možno raziskovanje tudi karakteristike naključnih RNA. Ob zavedanju zagotove povezave med strukturo in biološko funkcijo molekul, so se odločili da pred naključnim iskanjem funkcionalne RNA, naredijo še nekaj strukturnih študij z uporabo RNA Foster (RNA stabilnostni test zvijanja). Test omogoča določiti navzočo in termično stabilnost sekundarnih domen v RNA molekulah. To določimo s sklopljeno encimsko razgradnjo s toplotno denaturacijo. Metoda vključuje specifično nukleazo S1, ki cepi aminokislinkso zaporedje, ki je v obliki enojne verige, v zelo širokem termičnem območju. Hkrati prepoznava prisotne dvojne verige in indirektne druge možne strukture. Zvite RNA so bolj odpornene nukleazo S1, kot razvite RNA. Slednje so mngo hireje razgrajujejo. Pri tem ko zvišujemo temperaturo, spreminjamo sekundarno zvito strukturo RNA, saj so dolčeni predeleli na molekuli termolabilni. Vezi znoraj teh predelov počijo in nastane nova sekundarna struktura, ki ima ponovno svojo temparaturo stabilnost (ko se temperatura poviša se destabilizira RNA zvitje - poruši se njena prvotna stabilnost- kar inducira bodisi globalno ali lokalno razvitje). Posledično postane enoverižna RNA dovzetna za S1 nukleazni napad. Najbolj stabilne nukleotidne sekvence pri visokih temperaturah bodo tiste, ki bodo imele sekundarno ali morda terciarno strukturo. Do sedaj najbolj splošni rezultati omenjene študije, ki ležijo na demonstraciji zvijanja RNA v kompaktno sekundarno strukturo, saj ima RNA kapaciteto do zvijanja, kljub odsotnosti selektivnega pritiska. To potrjuje hipotezo da sedaj vključene molekule v naše življenje, nimajo pomembne sposobnosti, vse dokler ni zagotovljena stabilna zvita oblika. Ena analizirana sekvenca ima nepričakovano celo višjo stabilnost kakor tRNA, ki je uporabljena kot kontrola pri 70°C. Tovrstna stabilna sekvenca ima temperaturo taljenja približno višjo od 80°C. Te rezultati so absolutno izjemni in jih lahko uporabimo za izbiro usmeritve in predlogov za nadaljnje študije.


»Minimalne celice« Ko pogledamo na moderne živeče celice je zelo težko, da ne bi z začudenjem omenili čudovito kompleksnost tisočih zapletenih gensko-metabolnih kompleksov, ki se pojavljajo v ozkem celularnem okolju. Poraja se nam tudi vprašanje, kako se je ta kompleksnost spontano organizirala skozi generacije in pozneje oblikovala evolucijo. Bili so časi, ko so obstajale veliko bolj enostavne celice, kakor sedaj moderne celice, in so bile žive. Le te so bile sposobne se razvijat, same vzdrževat in razmnoževat. Kako lahko raziskujemo tako enostavne in preproste celice? Takšni biološki subjekti dandanes več ne obstajajo v naravi, zato je sintetični pristop- tipičen za SB- edini način, da dobimo vpogled v fizične in kemične omejitve celice. Namen, da sestavimo sistem, kot je živeča celica (čeprav enostavna), potrebujemo veliko znanja o minimalnih bioloških organizmih, ki imajo značilnosti življenja. V tem kontekstu, je teorija o avtopoezi v veliko pomoč (samo živi organizmi so organizirani tako, da sami ustvarijo in vzdržujejo svojo strukturo, ter razmnožujejo). Teorijo sta predstavila in razložila v sedemdesetih letih (1970) Maturana in Varela. Avtopoeza (samo razmnoževanje) razlaga, da živa celica je fizični objekt, ki: (1) loči sama sebe od okolja, (2) obdaja sistem reakcije, pri katerih prihaja do preoblikovanja prisotnih prekurzorje v okolju, v enake molekule, ki omogočajo reakcijske sisteme in (3) kljub nenehnemu nastajanju celičnih molekularnih sestavin, avtopoetični sistem vzdržuje svojo lastno identiteto, ter dinamične in prostorske pogoje organizacije.

Pristopi ustvarjanja minimalnih celic: - minimalne celice iz preprostih, prisotnih molekul: maščobnih kislin, ribocimov, enostavnih peptidov: konstruiranje enostavnega ribocimsko-lipidnnega modela. Omejen model, zaradi nizke reaktivnosti ribocimov in nizke katalitične aktivnosti kratkih peptidov. - Popolno sintetični model: osnovan na polimerih, PNA, razdelanih tranzicijskih kovinskih katalizatorjih. Tvorba emulzno vodo-oljnih kapljic: alternativni sintetični sitem za izgradnjo celičnih modelov, ampak nastala membrana nima lastnosti polprepustnosti. - »Pol-sintetični« model, ki vsebuje podobno strukturo celici. Struktura, znotraj liposoma, ima omejeno minimalno število dostopnih DNA, RNA in proteinov. Trenutno ta pristop izvira iz združevanja liposomske tehnologije in proste celične tehnologije. - PURE sistem (protein synthesis using recombinant elements), sinteza proteinov in vitro z uporabo očiščenih komponent: proizvodnja labilnih proteinov, ki se nato vstavijo v liposom cca. 80 transkripcijskih/translacijskih makromolekul. Sinteza proteinov se da rekonstruirati iz njenih prečiščena sestavnih delov. Sistem je zlahka dizejniran glede na zahteve ali sintezo proteinov, z manipuliranjem komponent v sistemu. Študije so pokazale, da esencialne znotrajcelične funkcije živih celic so kodirane preko minimalnega števila genov, okrog 200. To trditev so pokazale študije primerjalne genomike, ki so bile izvajane na najmanjših živečih organizmih (po navadi znotrajcelični paraziti ali simbionti): ½ genov za sintezo in procesiranje proteinov, ½ genov za pridobivanje energije in metabolne procese, sintezo DNA in membrane. CSB je usmerja in osredotočena na sintezo proteinov znotraj liposoma: GFP, β-galaktozidaza, Qβ-replikaza, α-hemolizin in T7 RNA polimeraza. Raziskali so tudi fizikalne detajle topnih komponent, ki so se spontano zvile in bile skupaj prisotne v notranjosti samo-nastalega liposoma. Znotraj 200 nm veziklov so uspeli povezati topne in sintetizirane proteine. S pomočjo Cryo-TEM (cryo-transmission electron microscopy) so prešteli prisotne makromolekule v veziklu. Zanimivo je, da je večinoma liposomov bila praznih ali pa so vsebovali pričakovano število topnih komponent. Približno 0,1% liposomov vsebuje zelo visoko število topnih komponent in s tem presegla vsaj en red pričakovane koncentracije- zagotavljanje celičnega metabolizma čeprav izhajajo iz razredčene raztopine.

Zaključek Z uporabo kemične in biokemične tehnologije, ustvarjamo biološke strukture, ki so alternativne strukturam, ki se nahajajo v naravi. Odgovarjajoče raziskave so osnovane na razvoju peptidnih in RNA knjižnic in na povezovanju topnih snovi (topljencev) v notranjost veziklov. Ti pristopi nam podajajo raznovrstne nove oblike, ki odgovarjajo novim zamisli. Te zamisli so pomembne, saj bi z njimi bolje razumeli kako so sestavljeni biološki sistemi in kako delujejo, kot tudi za morebitne nove biotehnološke pristope. NBRNA bodo morda postala nova terapevtska sredstva. Ko so minimalne celice pravilno ustvarjene dobijo morebitno vlogo dostavnih sistemov za zdravila.


Literatura o C. Chiarabelli, P. Stano in P. Luigi Luisi: Chemical synthetic biology: a mini-review, Synthetic Biology Applications in Industrial Microbiology, 2014 o Vitor B. Pinheiro in sod.: Synthetic genetic polymers capable of heredity and evolution, Science. 2012; 336(6079): 341–344 o A, C Forster in G. M Church: Towards synthesis of a minimal cell, Molecular Systems Biology 2006, 1744-4292 o P.Kristensen in G.Winter: Proteolytic selection for protein folding using filamentous bacteriophages, Folding & Design, 1998, 3:321-328 o P. Luigi in C.Chiarabelli: Chemical Synthetic Biology, John Wiely & sons, 1ed, 2011

Personal tools