Makrofagi iz gensko spremenjenih prašičev z delecijo domene CD163 SRCR5 odporni na okužbo s PRRSV

From Wiki FKKT

Jump to: navigation, search

Precision engineering for PRRSV resistance in pigs: Macrophages from genome edited pigs lacking CD163 SRCR5 domain are fully resistant to both PRRSV genotypes while maintaining biological function

Prašičji reprodukcijski in respiratorni sindrom (PRRS) je virusna bolezen prašičev, ki jo povzroča RNA virus iz družine Arteriviridae. Bolezen se pojavlja v dveh oblikah; respiratorna oblika se kaže v visokem deležu poginulih mladičev, reproduktivna oblika pa v povečanem številu abortusov in mrtvorojenih plodov. S tem predstavlja velik ekonomski problem, letna izguba v ZDA naj bi bila več kot 650 milijonov ameriških dolarjev. Z metodo urejanja genoma CRISPR/Cas9 so pripravili prašiče, ki ne vsebujejo domene SRCR5 receptorja CD163. Izolirani monociti in makrofagi iz teh gensko spremenjenih prašičev so bili odporni na virusno okužbo s PRRSV. Drugi ekipi znanstvenikov je poprej uspelo pripraviti knock-out prašiče, ki nimajo celotnega CD163. V tej raziskavi pa so odstranili le domeno SRCR5, s tem pa je receptor ohranil svojo biološko funkcijo.

Contents

Receptor CD163

PRRSV okuži le določeno vrsto celic: prašičje monocite/ makrofage, kjer se veže na receptor CD163, domena SRCR5 (ang. scavenger receptor cysteine-rich domain 5) pa predstavlja mesto interakcije z virusom. CD163 kodira 16 eksonov, eksoni 2-13 zapisujejo za domene SRCR. Sedmi ekson zapisuje za domeno SRCR5. CD163 se v veliki meri izraža na površini makrofagov, predvsem v respiratornem sistemu. Ima številne biološke funkcije, med drugim sodeluje pri sistemskem vnetju in odstranjuje hemoglobin iz krvne plazme. Pri okužbi s PRRSV sodeluje pri vstopu virusa v celico.

Priprava prašičev z delecijo domene CD163 SRCR5 s tehniko CRISPR/Cas9

Z tehniko CRISPR/Cas9 so izrezali ekson 7 s pomočjo dveh (SL26 in SL28) enoverižnih usmerjevalnih RNA (ang. single guide RNAs), prva se je nahajala med intronom 5' in eksonom 7, druga pa med eksonoma 7 in 8. Obe sgRNA so mikroinjicirali v citosol zigote skupaj z mRNA, ki je kodirala nukleazo Cas9. Zigote so gojili v in vitro kulturi do stopnje blastociste in s pomočjo analize s PCR ugotovili, da 2 od 17 blastocist vsebujejo 450 bp dolgo delecijo, sekvenciranje zaporedja pa je potrdilo da gre za delecijo eksona 7. Uspešnost postopka urejanja genoma so ocenili na 11,7%.

Zigote, ki so jim injicirali sgSL26, sgSL28 in Cas9 mRNA, so ustavili v jajcevod prejemniške samice. Od 32 rojenih mladičev so 4 vsebovali želeno delecijo. Pri treh je prišlo do vključitve nove DNA na tarčno mesto verjetno zaradi popravljanja NHEJ (ang. nonhomologous end joining), eden od mladičev pa je vseboval želeno delecijo eksona 7 brez dodatnih insercij ali delecij nukleotidnega zaporedja. Slednjega so kasneje parili z enim od ostalih treh in dobili 2 homozigotne/bialelni živali v F1 generaciji z delecijo ΔSRCR5, 6 heterozigotnih živali in 4 živali divjega tipa. Iz skupine so izbrali 6 živali, ki so predstavljale vse tri genotipe in oba spola za nadaljnje poskuse.

Analiza makrofagov

DC163 se izraža na površini tkivnih makrofagov. Periferne monocite so diferencirali v makrofage in diferenciacijo potrdili z analizo specifičnih markerjev značilnih za makrofage. Prav tako so se na makrofagih PAM (ang. pulmonary alveolar macrophages) izražali vsi za njih značilni površinski proteini, tudi CD163 pri ΔSRCR5 živalih, kar nakazuje na pravilno zvitje receptorja kljub deleciji.

Okužba makrofagov z virusom PRRSV in rezultati

Poznamo dva genotipa virusa PRRSV, genotip 1 najdemo v Evropi in Aziji, genotip 2 pa v Ameriki in Aziji. V poskusu so okužili izolirane makrofage iz heterozigotne živali ter živali divjega tipa in prišlo je do okužbe celic, ki so bile CD163 pozitivne. Med tem ko makrofagi iz ΔSRCR5 živali niso bili okuženi in ni prišlo do replikacije virusa obeh genotipov. Poskusi so potrdili, da je receptor CD163 odgovoren za vstop virusa v celico in slačenje virusne ovojnice. CD163 je eritroblastni vezavni faktor, spodbuja preživetje, proliferacijo in diferenciacijo nezrelih eritroblastov ter deluje kot hemoglobin-haptoglobinski receptor (domena SRCR3). Prosti hemaglobin je toksičen za celice, zato je pomembno, da ga makrofagi endocitozirajo. Zanimivo je, da za domeno SRCR5 niso našli nobene biološke funkcije, ΔSRCR5 makrofagi pa so ohranili funkcijo vezave hemoglobina.

Zaključek

Raziskovalcem je uspelo z urejanjem genoma pripraviti zdrave prašiče, ki nosijo delecijo CD163 SRCR5, imajo ohranjeno funkcijo proteina in niso dovzetni za okužbo z obema genotipoma virusa PRRSV. Samo učinkovitost tehnike CRISPR/Cas9 sicer ocenjujejo kot nizko. Mnogi znanstveniki poročajo, da se lahko učinkovitost poveča z elektroporacijo reagentov CRISPR/Cas9 v zigoto in vitro. Elektroporacija in vivo pa bi odstanila potrebo po donorski živali, vendar se tak postopek do sedaj uporablja le pri miših. Bolj učinkovito naj bi bilo tudi injiciranje ribonukleoproteinov Cas9/sgRNA v primerjavi z injiciranjem mRNA.

Vir

C. Burkard, S. G. Lillico, E. Reid, B. Jackson, A. J. Mileham, T. Ait-ali, C. B. A. Whitelaw, and A. L. Archibald, “Precision engineering for PRRSV resistance in pigs : Macrophages from genome edited pigs lacking CD163 SRCR5 domain are fully resistant to both PRRSV genotypes while maintaining biological function,” pp. 1–28, 2017.

Pojdi nazaj na MBT seminarji 2017.

Personal tools