Metabolno inženirstvo bakterije Escherichia coli za de novo sintezo vitamina B12

From Wiki FKKT

Jump to: navigation, search

Vitamin B12 ali kobalamin označuje skupino spojin, za katere je značilen korinski obroč s koordiniranim kobaltovim(III) ionom in spodnjim aksialnim ligandom dimetilbenzimidazol ribonukleotidom. Zgornji aksialni ligandi se med oblikami vitamina B12 razlikujejo, v človeškem telesu biološko aktivna oblika koencim B12 pa je 5'-deoksiadenozilkobalamin. Kot kofaktor je ključen za delovanje metionin sintaze in metilmalonil-CoA mutaze. Vitamin B12 v naravi lahko proizvedejo zgolj nekatere bakterije in arheje, ljudje pa ga v telo vnesemo pretežno z živili živalskega izvora [1]. Pomanjkanje vitamina B12 je značilno za nekatera bolezenska stanja, podhranjenost in napake v njegovi absorbciji. Odraža se v hematoloških in nevroloških nepravilnostih [2]. Zaradi potrebe po oralnem ali intramuskularnem nadomeščanju vitamina B12 je zanimanje za optimizacijo biotehnološke sinteze vseskozi prisotno.

Contents

Biotehnološko pridobivanje vitamina B12

Bakterije, ki so sposobne sinteze kobalamina ločimo glede na aerobno (značilna za rod Pseudomonas) oz. anaerobno pot sinteze (rodova Bacillus in Salmonella). Najpogosteje uporabljena mikroorganizma v biotehnološki proizvodnji sta Pseudomonas denitrificans ter Propionibacterium freundenreichii. Maksimalni izkoristki biotehnološke proizvodnje so ca. 200 mg kobalamina na liter kulture. Sevi, ki so v industrijski uporabi, so prešli veliko stopenj optimizacije pogojev rasti ter izboljšanj z mutagenezo in genskim inženirstvom [3].

Sinteza vitamina B12 v bakteriji Escherichia coli

V primerjavi z vrstami, ki se sedaj uporabljajo za proizvodnjo vitamina B12, je bakterija E. coli bolj primerna, saj ima bistveno krajši rastni cikel in uveljavljene postopke za gensko spreminjanje. Kitajski raziskovalci (Fang et al.) so zato rekonstruirali sintezno pot vitamina B12 v E. coli s pomočjo njej lastnih encimov iz reciklažne poti kobalamina ter encimov, ki jih v aerobnih ali anaerobnih poteh sinteze uporabljajo druge bakterije. Kot vir genov za encime biosintezne poti so uporabili bakterije Rhodobacter capsulatus, Brucella melitensis, Sinorhizobium meliloti, Salmonella typhimurium in Rhodopseudomonas palustris. Konstrukte so združili v šest modulov, ki so skupaj vsebovali 32 genov. Modul 1 v celice vnese zapise za devet encimov aerobne poti za pretvorbo uroporfirinogena III (UroIII) v hidrogenobirinsko kislino pod kontrolo močnega promotorja T7. Modul 2 s štirimi encimi sodeluje pri pretvorbi hidrogenobirinske kisline v kob(II)irinsko kislino a,c-diamid (CBAD). Raziskovalci so ugotovili, da sistem, ki vsebuje zgolj modula 1 in 2, in vivo ne producira želenega produkta CBAD. Neujemanje z in vitro raziskavami so povezali z neuspešnim privzemom kobaltovih ionov v celico. Kot rešitev so v genom integrirali modul 3, ki vsebuje transporterje za vnos kobalta v celico. Tak sev E. coli ob prisotnosti modulov 1 in 2 uspešno sintetizira CBAD. Naslednji je bil modul 4, ki nosi zapise za pretvorbo CBAD in treonina, ki ga dodajamo v medij, v adenozilkobinamid fosfat. Modul 5 vsebuje encime lastne bakteriji E. coli, ki sicer delujejo v reciklažni poti vitamina B12. Štirje encimi delujejo pri sintezi spodnjega aksialnega liganda, kar omogoči pretvorbo adenozilkobinamid fosfata v končni produkt - adenozilkobalamin. Izpleni sevov E. coli, ki so vsebovali module 1–5, so bili med 1,2 in 2,2 μg adenozilkobalamina na gram suhe celične mase (μg/g DCW, ang. dry cell weight) [4].

Optimizacija postopka in povečanje izplena

Prva izboljšava ustvarjenega seva je bil dodatek modula 6, ki je namenjen povečanju količine UroIII. Ta se sicer endogeno proizvede v bakteriji E. coli in služi kot substrat za sintezo kobalamina. Encime za sintezo UroIII so izrazili še heterologno s pomočjo genov iz R. palustris in S. meliloti. Vnos je poleg povečane produkcije začetnih spojin v sintezni poti povzročil tudi nalaganje hema, ki na celice deluje toksično. Efekt so izničili z vnosom siRNA za utišanje genov hem, ki niso vključeni v sintezo vitamina B12. Modul 6 so integrirali v genomsko DNA in s tem povečali izplen na 5,75 μg/g DCW. Raziskovalci so nato izboljšali še modul 2, saj se je za ozko grlo sinteze izkazal proces kelacije kobalta. Za najboljšo izbiro izmed preizkušenih se je izkazala kelataza iz R. capsulatus ter dodatek encima CobW, ki naj bi prispeval k izboljšanju funkcije kelataz. Izboljšali so tudi modul 4 za sintezo adenozilkobinamid fosfata, kjer so načrtno preizkusili kombinacije encimov iz treh izhodnih organizmov, ki so bili viri genov za sintezno pot. Najustreznejša kombinacija je povečala izplen na 171,81 μg/g DCW. Sledila je še optimizacija pogojev fermentacije. Optimizacija količin ključnih prekurzorjev sinteze (glicina, sukcinata in betaina) v gojišču je izkoristek povečala na 255,68 μg/g DCW. Preverili so tudi vpliv temperature gojenja in koncentracije IPTG. Večji vpliv na izplen je imela temperatura, optimalna pogoja za gojenje pa sta temperatura 32 °C in indukcija z IPTG v koncentraciji 1 mM. Izplen se je povečal na 307,00 μg/g DCW [4].

Zaključek

Raziskovalci so prvi uspešno v celoti sintetizirali adenozilkobalamin v bakteriji Escherichia coli. V procesu optimizacije postopka so izplen povečali za 250-krat glede na začetnega. Dobljen izkoristek 0,67 mg vitamina B12 na liter kulture še vedno ni primerljiv z zdaj uporabljanimi industrijskimi sevi P. denitrificans in P. freundenreichii (izkoristek ca. 200 mg/L kulture). Bakterija E. coli bi bila vseeno lahko v prihodnosti uporabna za industrijsko proizvodnjo vitamina B12, saj ima v primerjavi z do sedaj uporabljenimi mikroorganizmi znatno krajši rastni cikel in bolje uveljavljene postopke za gensko spreminjanje.

Literatura

[1] D. S. Froese, B. Fowler, M. R. Baumgartner: Vitamin B12, folate, and the methionine remethylation cycle – biochemistry, pathways, and regulation. J. Inherit. Metab. Dis. 2019, 1–13. doi: 10.1002/jimd.12009.

[2] M. J. Shipton, J. Thachil: Vitamin B12 deficiency – A 21st century perspective. Clin. Med. 2015, 15(2), 145–150. doi: 10.7861/clinmedicine.15-2-145.

[3] K. Piwowarek et al.: Propionibacterium spp. – source of propionic acid, vitamin B12, and other metabolites important for the industry. Appl.Microbiol. Biotechnol. 2018, 102, 515–538. doi: 10.1007/s00253-017-8616-7.

[4] H. Fang et al.: Metabolic engineering of Escherichia coli for de novo biosynthesis of vitamin B12. Nat. Commun. 2018, 9(1), 4917. doi: 10.1038/s41467-018-07412-6.

Personal tools