Molekularni inženiring funkcionalnih siRNA

Izhodiščni članek: Molecular Engineering of Functional SiRNA Agents

Uvod

RNAi je celični obrambni mehanizem, ki uravnava izražanje genov. Zavira izražanje genov z razgradnjo določenih mRNA, s čimer preprečuje sintezo ciljnih proteinov. Mehanizem so terapevtsko izkoristili z uporabo majhnih interferenčnih RNA (siRNA), ki omogočajo ciljno utišanje genov, povezanih z boleznimi. Visoka specifičnost in učinkovitost RNA interference pri utišanju genov je omogočila razvoj terapij na osnovi siRNA, namenjenih zdravljenju različnih bolezni, vključno z redkimi dednimi motnjami, določenimi vrstami raka ter virusnimi okužbami [1]. Molekule siRNA za namen terapije so večinoma sintetizirane kemijsko in pogosto vsebujejo umetne modifikacije za povečanje stabilnosti in zmanjšanje imunogenosti, kar pa lahko povzroči nepredvidene stranske učinke. Obstaja tudi tveganje za kontaminacijo z endotoksini. Zato se povečuje zanimanje za proizvodnjo bolj naravnih molekul siRNA, ki ohranjajo endogene lastnosti. Raziskovalci so pa razvili metodo za bioinženiring molekul siRNA z uporabo bakterijske fermentacije. Metoda temelji na nosilcih pre-miRNA, združenih s tRNA, in omogoča proizvodnjo številnih bioinženirskih molekul siRNA v živih gostiteljskih celicah [2].

Načrtovanje, izražanje in izolacija rekombinantnih molekul siRNA

Človeško tRNA za glicin z zaporedjem GCC (BioRNAGly) so povezali z optimiziranim zaporedjem pre-miR-34a, da bi ustvarili stabilen nosilec za majhne RNA molekule. tRNA/pre-miRNA nosilec zagotavlja strukturno stabilnost in omogoča učinkovito proizvodnjo ter procesiranje funkcionalnih molekul siRNA. Na tej osnovi so uspešno razvili devet različnih konstruktov BioRNA/siRNA, usmerjenih proti različnim genom. Kompleks tRNA/pre-miRNA služi kot nosilec za siRNA duplekse. Vsaka BioRNA/siRNA je bila izdelana z vstavitvijo specifičnega dupleksnega zaporedja siRNA namesto nativnega dupleksa miR-34a v skelet tRNA/pre-miRNA. Konstrukte so vstavili v vektor pBSTNAV in transformirali v celice E. coli HST08. S platformo so ustvarili panel devetih konstruktov BioRNA/siRNA, vključno z FDA odobrenimi terapevtiki (TTR-siRNA in ALAS1-siRNA), tudi kandidati v kliničnih ali prekliničnih študijah (VEGFR-siRNA, PD-1-siRNA, PD-L1-siRNA, BCL2-siRNA) in tri pogosto uporabljene siRNA v raziskavah (GFP-siRNA, Luciferase-siRNA, CDK6-siRNA). Izvedli so fermentacije v majhnem (15 mL) in velikem (0,25 L) volumnu kultur. Z Urea-PAGE analizo in z uporabo majhneg volumna kultur so opazili prekomerno izražanje vsakega konstrukta BioRNA, ki so predstavljale več kot 50 % vseh RNA v vzorcu in 100% uspešnost pri vseh konstruktih. Po potrditvi izražanja so povečali volumen kultur za proizvodnjo večjih količin vsake BioRNA/siRNA za izolacijo in testiranje. Za vsak konstrukt so gojili kulture E. coli (250 ml) in iz odvzetih celic izolirali skupno RNA. Za čiščenje siRNA so uporabili kromatografijo FPLC. Čistost so ocenili z urea-PAGE in HPLC in vsi BioRNA/siRNA so dosegli >98 % čistost. Tudi so izmerili endotoksine z LAL testom in so vsi vzorci imeli nizko aktivnost endotoksinov (<5 EU/μg RNA). Zagotavljanje nizke vsebnosti endotoksinov je bistvenega pomena za uporabo RNA v terapevtske namene, saj lahko bakterijski endotoksini sprožijo močne vnetne odzive. Izkoristek iz 0,25 l kulture je bil od približno 3 mg do 10 mg prečiščene RNA na konstrukt [2].

Utišanje genov s siRNA

Preverili so, če biološko ustvarjene siRNA sposobne utišati gene v celicah. Testirali so tri reprezentativne BioRNA/siRNA v celičnih testih: BioRNA/GFP-siRNA, BioRNA/BCL2-siRNA in BioRNA/PD-L1-siRNA. GFP-siRNA je izbran zaradi svoje pogoste uporabe v raziskovalne namene, BCL2-siRNA kot terapevtski kandidat pri raku in PD-L1-siRNA kot imunoterapevtski pristop v onkologiji. Ocenili so uspešnost glede na njeno sposobnost zorenja v aktivno obliko siRNA v človeških celicah in zmanjšanja izražanja ciljnega gena [2].

BioRNA/GFP-siRNA

Za preverjanje aktivnosti BioRNA/GFP-siRNA so naredili transfekcijo bioinženirske RNA v linije rakavih celic, ki izražajo zeleni fluorescenčni protein (GFP). Uporabili so tri modele celic, ki izražajo GFP in sicer iz različnih vrst raka (A549-GFP-Luc, Huh7-GFP-Luc ter 143B-GFP-Luc celice). Spremljali so raven izražanja GFP s fluorescenčno mikroskopijo in kvantitativno analizo slik ob 24, 48 in 72 ur po transfekciji. Rezultati so pokazali izrazito zmanjšanje fluorescence GFP že 24 ur po transfekciji z BioRNA/GFP-siRNA v primerjavi s kontrolo. Po 48 in 72 urah po transfekciji z BioRNA so v celicah opazili dodatno redukcijo GFP signala, kar nakazuje na postopno utišanje izražanja reporterja. V vseh testiranih celičnih linijah so opazili postopno zmanjševanje fluorescence skozi čas, kar potrjuje, da je vnesena BioRNA stabilna, funkcionalna in ohranja funkcijo vsaj več dni po transfekciji. Pri celicah, tretiranih s kontrolo, ter pri netretiranih celicah ni prišlo do opaznih sprememb v izražanju GFP. To potrjuje, da je utišanje rezultat delovanja siRNA specifične za GFP in da lahko sredstva BioRNA/siRNA vstopijo v človeške celice in sproščajo funkcionalne siRNA [2].

BioRNA/BCL2-siRNA

Nato so testirali konstrukt BioRNA/BCL2-siRNA in ga primerjali s kemično sintetizirano siRNA enakega zaporedja. BCL2 (angl. B-cell lymphoma 2) je onkogen, ki rakavim celicam omogoča izogibanje apoptozi. Ker lahko utišanje gena BCL2 sproži apoptozo v tumorskih celicah, je le-ta pomembna terapevtska tarča pri zdravljenju raka. Izvedli so transfekcijo človeških celic nedrobnoceličnega pljučnega raka (NSCLC) z BioRNA/BCL2-siRNA, s kemično sintetizirano siRNA BCL2 ter z ustreznimi kontrolami. Uporabili so RT-qPCR z oligonukleotidom steblo-zanka (angl. stem-loop RT-qPCR), ki omogoča natančno pomnoževanje zrele oblike zaporedja siRNA proti BCL2. Po 48 urah po transfekciji so zaznali prisotnost zrele oblike siRNA proti BCL2 tako v celicah, transfeciranih z BioRNA/BCL2-siRNA kot s sintetično siRNA. Zanimivo je dejstvo, da so celice, transfecirane z BioRNA/BCL2-siRNA, pokazale bistveno višje ravni zrele siRNA kot celice, transfecirane s sintetično siRNA (pri enaki koncentraciji 15 nM). Ta rezultat nakazuje, da je biološko zasnovana RNA morda učinkoviteje sprejeta in stabilnejša od sintetične oblike. Po meritvi izražanja gena BCL2 po 48-72 urah, je BioRNA/siRNA pokazala enako ali večjo učinkovitost utišanja genov v primerjavi z običajnimi siRNA. Obe siRNA sta učinkovito znižali raven BCL2 mRNA. Natančneje, BioRNA/BCL2-siRNA je v dveh celičnih linijah NSCLC zmanjšala raven BCL2 mRNA za približno 70-80 %, raven proteinov pa za 60-75 %, kar je bilo enako ali boljše od utišanja, doseženega s sintetično siRNA. Te ugotovitve nakazujejo na to, da biološko sintetizirana siRNA ne le učinkovito opravlja svojo funkcijo, temveč je sposobna celo preseči delovanje standardne sintetične siRNA. Razlog za povečano učinkovitost BioRNA v celici bi lahko ležal v ohranjenosti strukture pre-miRNA, kar bi encimu Dicer olajšalo prepoznavanje. Lahko pa gre tudi za odsotnost kemičnih modifikacij, ki lahko pri sintetičnih oblikah ovirajo nadaljnjo obdelavo [2].

BioRNA/PD-L1-siRNA

Preverili so tudi delovanje BioRNA/PD-L1-siRNA v okviru imunoterapije raka. PD-L1 (angl. programmed death-ligand 1) je protein, ki ga izražajo tumorske celice in se veže na PD-1 na T celicah in zavira imunski odziv. Blokiranje PD-L1 je mehanizem po katerem delujejo mnoga biološka zdravila za raka, odobrena s strani FDA. Naredili so transfekcijo BioRNA/PD-L1-siRNA v celice NSCLC in ovarijske celice kitajskega hrčka (CHO). Selektivna analiza z RT-qPCR metodo je po 48 urah potrdila močno prisotnost zrele oblike siRNA, usmerjene proti PD-L1. Tudi kasnejše analize RT-qPCR in Western blot so pokazale znatno znižanje ravni mRNA PD-L1 (30-60 %) in proteina (70-80 %) v primerjavi s kontrolo. Imunofluorescenčna analiza je le potrdila predhodne ugotovitve, saj je pokazala zmanjšano izražanje PD-L1 na celični membrani [2].

Za oceno posledic zmanjšanja izražanja PD-L1 so uporabili reporterski test, ki meri prekinitev signalizacije PD-1/PD-L1. V eksperimentu so uporabili gensko spremenjene T-celice Jurkat, ki izražajo PD-1 in celice CHO, ki prekomerno izražajo PD-L1. Test, ki posnema interakcije med T-celicami in tumorskimi celicami, je pokazal, da je BioRNA/PD-L1-siRNA uspešno zmanjšala izražanje PD-L1, obnovila signalizacijo T-celičnih receptorjev in aktivirala nadaljnje imunske odzive, kar se kaže v povečani luminiscenci. BioRNA/PD-L1-siRNA torej ne zgolj utiša ciljni gen, temveč tudi sproži imunsko aktivacijo z mogočim antitumorskim učinkom [2].

Zaključek

Prihodnost terapija z RNAi je obetavna in odpira nove možnosti za zdravljenje prej neozdravljivih bolezni, vključno z genetskimi motnjami, boleznimi srca in ožilja, rakom, sladkorno boleznijo in virusnimi okužbami. Nedavne odobritve s strani FDA in številne klinične študije poudarjajo njen naraščajoči terapevtski potencial. Batra in sod. so so v raziskavi uspešno uporabili inovativen bioinženirski pristop z uporabo nosilca pre-miRNA s človeško tRNA, za proizvodnjo funkcionalnih BioRNA/siRNA. Slednje se razlikujejo od kemično sintetiziranih siRNA, ker so v živih celicah podvržene naravnim posttranskripcijskim modifikacijam, pri čemer fizikalno-kemijske lastnosti in biološka aktivnost odražavajo naravne značilnosti RNA. Pokazali so, da proizvedena BioRNA/siRNA učinkovito uravnavava izražanje ciljnih genov, kar ponuja trajnostno in cenovno ugodno strategijo za proizvodnjo siRNA. Metoda naredi velik korak naprej za terapevtske možnosti, kar ima pomembne posledice za širok spekter bolezni [2].

Literatura

[1] S. Malakondaiah, A. Julius, D. Ponnambalam, S. S. Gunthoti, J. Ashok, P. S. Krishana, J. Rebecca: Gene silencing by RNA interference: a review. Genome Instability & Disease 2024 5:5 2024, 5, 225–241.

[2] N. Batra, M. J. Tu, A. M. Yu: Molecular Engineering of Functional SiRNA Agents. ACS Synth Biol 2024, 13, 1906–1915.