Načrtovanje močnih inducibilnih sinteznih promotorjev v kvasovkah

Izhodiščni članek: Designing strong inducible synthetic promoters in yeasts

Uvod

Promotorji so v sintezni biologiji ključnega pomena za natančno uravnavo ravni izražanja genov. Medtem ko lahko v prokariontih s precejšnjo lahkoto spreminjamo moč promotorja je ta naloga pri evkariontih precej bolj zapletena, saj imajo le te veliko bolj kompleksno delovanje in regulacijo. Tudi promotorji kvasovk so nam še vedno precejšnja uganka, kljub temu da so kvasovke, predvsem S. cerevisiae, že vrsto let eden izmed ključnih modelnih organizmov. Zato se v sintezni biologiji kvasovk, še vedno v precejšnji meri uporabljajo nativni promotorji, ki so dobro raziskani. Alternativa slednjim bi lahko bili inducibilni sintetični promotorji. Raziskovalci so zasnovali številne sintetične osrednje promotorje z nativnimi zgornjimi aktivacijskimi elementi [1].

Strategije načrtovanja močnih inducibilnih sintetičnih promotorjev v kvasovkah

Inducibilni sinetični promotorji vsebujejo dva osnovna gradnika in sicer TATA-zaporedje in zgornje bakterijske operatorje. Te promotorje so optimizirali s tremi metodami. Pred operatorje so vstavili dolgo izolacijsko zaporedje ( > 1-kbp), ki onemogoči neželeno aktivacijo s strani oddaljenih ojačevalcev. Fuzija bakterijskih operatorjev direktno na zaporedje-TATA ojača aktivacijo. Povečevanje ponovitev operatorjev lahko zamnjša puščanje in izboljša raven ekspresije [1].

Puščanje močnih inducibilnih sintetičnih promotorjev v kvasovkah

Raziskovalci so izdelali sintetični promotor inducibilen z 1-(3-Acetil-2,4,6-trihydroksifhenil) etanon 2,4 (DAPG) v modelnem organizmu Komagataella phaffii (prej poznana kot Pichia pastoris). Najprej so 197bp osrednjega promotorja KpAOX1 fuzirali pod operator phlO. Torej, ko je prisoten DAPG v gojišču se le ta poveže z trnskripcijskim aktivatorjem, ki se veže na opertor, kar omogoči izražanje gena pod promotorjem KpAOX1. Moč promotorjev so karakterizirali z izražanjem EGFP (angl. enhanced green fluorescent protein). Kvasovke v katerih je bil prisoten plazmid z zgoraj opisanim konstruktom so izkazovale več kot >100-krat višjo raven ekspresije EGFP, tudi v odsotnosti induktorja DAPG. Po dodatku DAPG se je fluorescenca povišala za 8-krat. To nakazuje na močno puščanje tega sintetičnega promotorja. Raziskovalci so to težavo rešili tako, da so navzgor nad promotor vstavili genske fragmente v dolžini do 1,6 kb. Tako so zmanjšali puščanje za kar 376-krat medtem, ko se je raven ekspresije ob indukciji zmanjšala le za 1,6-krat. Razloga za puščanje tovrstnih promotorjev sta po navadi dva: endogeni transkripcijski aktivatorji, ki se lahko nahajajo tudi več kot 1kb navzgor od promotorja in pa prepisovanje izven gena (angl. transcriptional readthrough) [1].

Načrtovanje močnega sintetičnega promotorja z minimalnim številom endogenih elementov

Kljub temu, da se v nekaterih člankih omenja velik vpliv oddaljenosti TATA-zaporedja od startkodona, ga tu pri svojih eksperimentih raziskovalci skoraj niso [2]. Minimalni sintetični promotor lahko v tem primeru vsebuje le bakterijski operator, TATA-zaporedje in kratek vmesnik. Da bi razširili uporabnost teh promotorjev so avtorji izhodiščnega članka načrtali še močne inducuibilne sintetične promotorje v Saccharomyces cerevisiae. Že izredno kratek promotor z dolžino 110 bp z osrednjim promotorjem ScGAL1 fuziran z operatorjem phlO je dosegel >100-krat višjo raven ekspresije ob indukciji z DAPG. Ključ do tega uspeha leži v tem, da so TATA-zaporedje postavili takoj ob bakterijski operator [1].

Ponovitve operatorske regije za povišanje izražanja

Ko so avtorji ugotovili način za zmanjšanje puščanja promotorjev so se odločili, da bodo okarakterizirali še vpliv popnovitev različnih operatorskih regij, na raven izražanja proteina pod takšnim promotorjem. Uporabili so induktorje DAPG, doksiciklin (Dox) in homoserin lakton (HSL), ki se vežejo na operatorje phlO, tetO2 in luxO. Dve ponovitvi operatorja phlO povečata ekspresijo GFP za >2000-krat, 6 ponovitev operatorske regije pa ob indukciji z DAPG že kar za >3000-krat. Seveda razmerje med številom operatorjev in močjo indukcije ni monotono. Pri KpHSL-ON stikalu so naleteli na težavo, saj tudi pri 10 ponovitvah luxO ni prišlo do pričakovanega dviga ravni izražanja. Zato so se avtorji članka odločil, da bodo del luxO zamenjali z ostalimi luxO variantami iz bakterije Aliivibrio fischeri. Na tak način so se izognili kriptični aktivaciji promotorja in statistično signifikantno povečali njegovo moč [1].

Proizvodnja bioterapevtikov s pomočjo močnih inducubilnih sintetičnih promotorjev

Raziskovalci so uprabili KpDAPG-ON sistem za produkcijo nanotelesa ALX-0171 (gontivimab). Gene za nanotelesa so na C-terminalnem koncu fuzirali s signalno sekvenco paritvenega faktorja alfa (MFα). Za izražanje tega nanotelesa so uporabili 419bp dolg močan promotor DAPG-iSynP, PKpPhl6.0, vsebujoč šest phlO ponovitev in 61bp dolg vmestnik navzgor od zaporedja-TATA. Izkazalo se je, da je sintetični promotor 5-krat učinkovitejši za tovrstno proizvodnjo nanotelesa, kot bolj komercialno uveljavljen način indukcije z metanolom. Dokazali so, da je z sintetičnimi inducibilnimi promotorji moč izražati dva različna proteina pod dva različnima promotorjema. To so storili tak, da so v en sev vsatvili zapise za dve nanotelesi ALX-0171 and ALX-0081 pod promotorjema pDAPG-ON in KpTet-ON. Ekspresija je bila uspešna, a le ob dodatku ustreznega induktorja [1].

Ekspresijski sistemi brez induktorja

Sistemi brez induktorja ali “Inducer-OFF” sistemi so pogosti v industriji, saj se z njimi lahko izognemo stroškom dodajanja induktorja. Tovrstni sistemi delujejo tako, da se ekspresija proteina prične šele, ko induktor odstranimo iz gojišča. Za ta namen so raziskovalci uporabili transkripcijski aktivator PhlTA, ki se deaktivira ob dodatku DAPG. Potem so ga še dodatno prilagodili za ta namen s pomočjo usmerjene evolucije. Najprej so z uporabo PCR mutrali phlTA. Potem so le tega vstavili v vektor, ki je vseboval že predhodno narejen sintetični promotor s šestimi ponovitvami phlO, ki so fuzirane na promotor ScGAL. Zatem so s pomočjo PCR podvrženega mutacijam, ustvarili dve knjižnjici z 93 kloni, ki so jih prečesali za ON/OFF indukcijo z 5 μM DAPG. Rezulatati so pokazali, da je bila ključna mutacija za izboljšavo “Inducer-OFF” sistema PhlTA (E41G). Ko so to varinato vnesli v K. phaffii je prišlo ob dodatku DAPG do 702-kratne redukcije v primeru 61bp dolgega distančnika pred TATA-zaporedjem in 1572-kratne redukcije v primeru 11bp dolgega distančnika [1].

Produkcija proteinov težavnih za ekspresijo

Nazadnje so želeli preveriti ali so sintetični promotorji lahko uporabni za proizvodnjo proteinov, ki so običajno precej problematični za proizvodnjo, kot je na primer receptor vezavno domeno (RBD^om) iz virusa SARS-CoV-2 variante omikron. Ta protein vsebuje kar 15 mutacij, ki zaznavno zmanjšajo njegovo stabilnost. Za namen izražanja proteina so uporabili KpDAPG-ON sintetični promotor pod katerega so klonirali RBD^om . Zaradi precejšnje nestabilnosti RBD^om so raziskovalci gojili produkcijski sev K. phaffii pri 18°C in 30°C, a so bili z izolacijo uspešni le pri kvasovkah gojenih pri 18°C, kar je v skladu s pričakovanji. V 225mL posodicah so uspeli proizvesti le 2,5mg proteina, kar je v skladu z pričakovano nizko stabilnostjo. Masna spekrometrija je pokazala, da je bil kljub precejšnji netabilnosti izražen celoten peptid, ki so ga na koncu uspešno uporabili za imunizacijo kokoši. Poleg tega so z metodo predstavitve na površini bakteriofagov razvili protitelesa IgY, ki se vežejo na izražen protein. Potem so s pomočjo eksperimenta ELISA in analize prenosa po Westernu pokazali, da ni velikih razlik v vezavi imunoglobulina na eksperimentalno proizveden RBD^om proti vezavi na ta protein divjega tipa [1].

Zaključek

V članku so raziskovalci demonstrirali učinkovite metode za pripravo različnih močnih inducibilnih močnih promotorjev v dveh pomembnih vrstah kvasovk Komagataella phaffii in Saccharomyces cerevisiae. Dokazali so tudi, da lahko z variacijo števila operatorjev na začetku promotorja variirajo izražanja proteina. Poleg tega so demonstrirali tudi možnosti za proizvodnjo industrijsko pomembnih proteinov s pomočjo tovrstnih promotorjev. Avtorje je presenetilo, da je le 94-bp dolga promotorska sekvenca lahko delovala, kot močan sintetični inducibilni promotor, ki je po svoji moči presegel vse naravne kvasne promotorje.

Literatura

[1] Tominaga, M., Shima, Y., Nozaki, K., Ito, Y., Someda, M., Shoya, Y., Hashii, N., Obata, C., Matsumoto-Kitano, M., Suematsu, K., Matsukawa, T., Hosoya, K., Hashiba, N., Kondo, A., & Ishii, J. (2024b). Designing strong inducible synthetic promoters in yeasts. Nature Communications, 15(1). https://doi.org/10.1038/s41467-024-54865-z

[2] Dvir, S., Velten, L., Sharon, E., Zeevi, D., Carey, L. B., Weinberger, A., & Segal, E. (2013). Deciphering the rules by which 5′-UTR sequences affect protein expression in yeast. Proceedings of the National Academy of Sciences, 110(30). https://doi.org/10.1073/pnas.1222534110