Novi peptidni prenašalci za vnos proteinskega tovora v celice in njegovo sproščanje iz endosomov

From Wiki FKKT

Jump to: navigation, search

Novel cell-penetrating peptide-adaptors effect intracellular delivery and endosomal escape of protein cargos

Contents

Uvod

V celice vstopajoči peptidi (ang. »cell-penetrating peptides« ali s kratico CPP), ki lahko prehajajo membrano sesalčjih celic, so predmet številnih raziskav in kliničnih študij, saj so potencialno uporabni kot prenašalci za vnos želenih snovi v celice. Navadno so to peptidi dolgi 10-30 aminokislin in sodijo med peptide bogate z argininom, amfipatične peptide bogate z lizinom ali hidrofobne peptide. Študije so pokazale, da njihovo delovanje ovirajo interakcije s sestavinami membrane zaradi katerih lahko ostanejo ujeti v le tej. Poleg tega vezava na membranske proteine vpletene v endocitozo pogosto ovira sproščanje kovalentno vezanih tovornih molekul iz endosomov. Da bi izboljšali omenjene slabosti, so Salemo in sodelavci oblikovali nov fuzijski protein TAT-CaM, ki uspešno dostavi ter sprosti tovor v citoplazmi celic.

Izvedba

Delovanje prenašalca

Fuzijski protein za vnos tovora so sestavili iz zaporedja iz transkripcijskega transaktivatorja virusa HIV (TAT), za katerega je znano, da omogoča prehod skozi membrano, in kalmodulina. Proteinu, ki so ga želeli vnesti, so na N-konec dodali kalmodulin-vezavno domeno (ang. »calmodulin-binding sequence« oz. CBS). V prisotnosti kalcija kalmodulin z visoko afiniteto veže kalmodulin-vezavno domeno, kar omogoči interakcijo med tovorom in fuzijskim proteinom, ki omogoča prenos v celico. Afiniteta kalmodulina do ligandov je v odsotnosti kalcija zanemarljiva, kar omogoči hitro sproščanje tovora po vstopu v citoplazmo, za katero je značilna nizka koncentracija kalcija.

Priprava prenašalca in tovornih proteinov

Fuzijski protein so izrazili v sevu bakterije E. coli BL21(DE3)pLysS in očistili s kovinsko afinitetno kromatografijo preko histidinske oznake. Zapise za tovorne proteine so optimizirali za izražanje v E. coli in jih s kloniranjem vnesli v vektor, ki je že vseboval zapis za kalmodulin-vezavno zaporedje. Tako pripravljene proteine so izrazili v sevu bakterije E. coli BL21(DE3)pLysS in očistili z afinitetno kromatografijo na sefarozni koloni z vezanim kalmodulinom. Kot tovor so uporabili po velikosti in strukturi različne proteine in sicer: mioglobin, hrenovo peroksidazo in β-galaktozidazo.

Testiranje vezave TAT-CaM s tovorom

Pripravi proteinov je sledilo merjenje afinitete vezave kalmodulina fuzijskega proteina in kalmodulin-vezavne domene tovora, za kar so raziskovalci uporabili bioplastno interferometrijo. Vse tri tovorne molekule so TAT-CaM vezale z nanomolarno afiniteto. Po dodatku EDTA, ki kompleksira kalcijeve ione, pa je prišlo do hitre disociacije kompleksa. Rezultati so pokazali, da so interakcije fuzijskega proteina in tovornih proteinov močne, reverzibilne in povsem primerljive z nativnimi interakcijami kalmodulina in njegovih ligandov.

Preverjanje učinkovitosti in varnosti

Učinkovitost vnosa tovora v celice s proteinom TAT-CaM so preverili na celični liniji ledvičnih fibroblastov mladičev hrčka (celična linija BHK). Poskus so izvedli tako, da so celice inkubirali z raztopino, ki je vsebovala fuzijski protein TAT-CaM in fluorescenčno označen tovorni protein v enaki koncentraciji ter pufer z CaCl2. Vnos fluorescenčno označenih tovornih molekul v celice so detektirali s fluorescenčno konfokalno mikroskopijo. Dostava vseh testiranih tovornih proteinov v citoplazmo celic je bila uspešna, kar potrjuje uporabnost metode za vnos različnih proteinov. V odsotnosti fuzijskega proteina TAT-CaM proteini v celice niso vstopali. Poskuse so raziskovalci uspešno ponovili na različnih celičnih linijah.

Pomembna ovira pri uporabi v celico vstopajočih peptidov je tudi citotoksičnost, še posebej zaradi visokih koncentracij, ki so navadno potrebne za doseganje sproščanja tovora iz endosomov. Študije so pokazale, da ima peptid TAT citotoksične učinke koncentraciji nekaj 10 µmol/l. S fuzijskim proteinom TAT-CaM pa so raziskovalci dosegli učinkovito dostavo tovora v citoplazmo že s koncentracijo 1 µmol/l, brez vpliva na preživetje celic, kar so merili z barvanjem s tripanskim modrilom.

Zaključek

Fuzijski protein TAT-CaM omogoča učinkovito in varno dostavo tovora v citoplazmo celic v manj kot 1 h. Avtorji raziskave so s svojim delom pomembno prispevali k izboljšanju uporabnosti in učinkovitosti v celice vstopajočih peptidov.

MBT seminarji 2017

Personal tools