PETal: izdelovanje eteričnega olja sandalovine iz PET plastike

PETal je iGEM projekt ekipe IISER-TVM iz Indije iz leta 2024. Z njim so osvojili nagradi najboljši projekt v kategoriji moda in kozmetika ter najboljši promocijski video.

UVOD

Indijsko olje sandalovine je ena izmed najbolj iskanih surovin v kozmetični industriji. PETal ponuja inovativno rešitev za njegovo proizvodnjo, ki združuje reciklažno plastičnih odpadkov in proizvodnjo tega dišavnega olja s pomočjo sintezne biologije. Z uporabo gensko spremenjene bakterije Pseudomonas putida, ki lahko presnavlja monomere polietilen tereftalata (PET), torej tereftalno kislino (TPA) in etilen glikol (EG), so želeli sintetizirati santalen in santalol, ki sta glavni sestavini olja sandalovine.

Olje sandalovine

Sandalovina je vrsta lesa iz dreves iz rodu Santalum. Les ima značilen vonj, ki ga, za razliko od drugih aromatičnih lesov, lahko ohrani več desetletij. Iz tega lesa pridobivajo tudi olje sandalovine, ki s svojim vonjem dopolnjuje mnoge dišave, mila in kozmetiko po vsem svetu. Najbolj cenjena vrsta, Santalum album (indijska sandalovina), raste izključno na polotoku Indije in velja za eno izmed najdragocenejših vrst lesa na svetu. Molekulska struktura komponent olja sandalovine je edinstvena med lesenimi notami v parfumeriji. Seskviterpena α-santalol in β-santalol sta glavna nosilca vonja, ki ju pridobivajo iz sredice drevesa s parno destilacijo. Pridobivanje olja sandalovine pa je zelo dolgotrajen in drag proces. Drevesa za svojo rast potrebujejo 15-20 let, za 600 mL olja pa je potrebnih kar 20 kg lesa. Povpraševanje po sandalovini in olju sandalovine iz leta v leto narašča, ponudba pa je, glede na potrebe trga, premajhna.

PET plastika

Polietilen tereftalat (PET) je tretji najbolj razširjen polimer v embalažni industriji in prevladuje na trgu plastenk za pijače. Hkrati je tudi najpogostejša oblika plastičnih odpadkov v okolju. Čeprav ga je mogoče reciklirati mehansko ali kemijsko, pa so ti postopki predragi, da bi z njimi ponovno pridobivali osnovne surovine, zato se reciklira manj kot 30 % letne proizvodnje. V zadnjem času se kot obetavna alternativa uveljavlja biološka nadpredelava (angl. upcycling), ki bi lahko rešila ekonomske izzive klasičnih metod reciklaže PET.

Izdelovanje eteričnega olja sandalovine iz PET plastike

Da bi učinkovito naslovili pomanjkanje olja sandalovine in hkrati vzpostavili trajnostno zanko z uporabo PET odpadkov, je skupina iz Indije zasnovala modularni sistem PETal, ki omogoča krožno rabo surovin in valorizacijo plastičnih odpadkov. Polietilen tereftalat (PET) je sestavljen iz monomerov tereftalne kisline (TPA) in etilenglikola (EG). Z uporabo že prilagojenega seva bakterije Pseudomonas putida, ki lahko presnavlja TPA in EG, so prvič v ta organizem vnesli biosintetsko pot za proizvodnjo santalola, s čimer so iz PET odpadkov želeli proizvajati santalen in santalol.

Izvedba projekta

Izbira organizma in reševanje težav pri gojenju s pristopom ALE

Za organizem je skupina izbrala bakterijo Pseudomonas putida KT2440, zaradi njenega prilagodljivega metabolizma, robustnosti in sposobnosti rasti na različnih substratih. Šlo je za sev TA7-EG, ki je bil genetsko prilagojen za presnavljanje prej omenjenih monomerov TPA in EG pri 'nevtralnem pH. Skupina je imela na začetku nekaj težav pri gojenju seva 'P. putida TA7-EG na monomerih PET, saj so bakterije znatno rast dosegle šele po 24-36 urah. Reševanja težave so se lotili s pristopom adaptivne evolucije. Začeli so z medijem, ki je poleg TPA in EG vseboval še 5 % glukoze, nato pa so njen delež postopoma zniževali, dokler ni v mediju ostala le še kombinacija TPA in EG oz. posamezen monomer. Namen tega je bil postopoma privaditi sev na rast zgolj na monomerih PET. Po tem postopku so opazovali rast prilagojenega seva v različnih medijih (TPA, EG in TPA+EG) z merjenjem optične gostote (OD). Rezultati so pokazali, da je prilagojeni sev prešel v logaritemsko fazo hitreje kot izvorni TA7-EG, ki je za to potreboval več kot 2 dneva. Najhitrejša rast je bila opažena v mediju s kombinacijo TPA in EG, medtem ko je bil EG sam po sebi manj učinkovit.

Inženiring presnovne poti

Njihova strategija je vključevala preusmeritev toka ogljika iz monomerov PET proti naravni metabolni poti MEP za sintezo terpenoidov ter vnos biosintetske poti za santalol. Ta vključuje izražanje treh ključnih encimov iz Santalum album:

• farnezil pirofosfat sintaza (FPPS),
• santalen sintaza (SaSSy),
• citokrom P450 monooksigenaza (CYP736A167) s svojim reduktaznim partnerjem (CPR1).

Vsi sestavljeni encimski deli so bili zasnovani modularno, z uporabo zamenljivih promotorjev in mest za vezavo ribosomov, kar bi omogočalo prihodnjim ekipam in raziskovalcem nadaljnje testiranje.

Metabolna pot MEP

Metil eritritol fosfatna pot (MEP) je odgovorna za biosintezo izoprenoidnih prekurzorjev v bakterijah in plastidih. Predstavlja presnovno alternativo bolj znani mevalonatni poti (MEV) za sintezo izoprenoidov, ki se pojavlja pri arhejah in evkariontih [2]. P. putida naravno vsebuje MEP pot, ki zagotavlja izoprenoidna prekurzorja IPP (izopentenil difosfat) in DMAPP (dimetilalil difosfat) iz centralnih metabolitov piruvata in gliceraldehid-3-fosfata. Ta naravna pot je dobro prilagojena gostitelju in lahko zagotovi zadostno količino prekurzorjev za proizvodnjo terpenoidov brez obsežnih gensko-inženirskih posegov. S pomočjo modeliranja je skupina predlagala presnovno pot, ki se začne s pretvorbo TPA in EG v piruvat in gliceraldehid-3-fosfat, ki ju encima DXS in DXR pretvorita v MEP. Nadalje se MEP preko encimov IspD, IspE, IspF, IspG in IspH pretvori v spojine IPP in DMAPP, ki vsebujejo 5 ogljikov. IPP molekule se nato združijo v spojino s 15 ogljiki, imenovano farnezil pirofosfat (FPP), pri čemer sodeluje encim FPPS (FPP sintaza). Čeprav je FPPS že prisoten v P. putida, so vnesli tudi gen za FPPS iz Santalum album, da bi zagotovili zadostno količino encima in nadzorovano izražanje pod inducibilnim promotorjem. FPP je končni produkt MEP poti in prekurzor za santalen. Santalen sintaza (SaSSy) deluje na FPP in sintetizira različne izomere, kot so endo-bergamoten, beta-santalen, (Z)-farnezen, epi-santalen in alfa-santalen. Izražanje FPPS in SaSSy je bilo že uspešno demonstrirano v E. coli, zato se je ekipa odločila uporabiti enak plazmid.

Testiranje izražanja FPPS in SaSSY

Uporabili so torej ekspresijski vektor pCDFDuet, ki je vseboval zapisa za encima FPPS in SaSSy iz Santalum album. Bakterije so transformirali z elektroporacijo in inducirali izražanje encima SaSSy z IPTG. Sledila je analiza izražanja proteina z barvanjem s Coomassie Blue in kemijska analiza z GC/MS. Izražanje encima SaSSy in sintezo santalena so sicer potrdili, vendar pa je bila koncentracija spojine v vzorcu razmeroma nizka. Za reševanje tega izziva so zasnovali konstrukt iz štirih osnovnih delov:

• promotor araBAD z RBS (BBa_K5181006),
• SaSSy (BBa_K5181004),
• IRES (BBa_K5181013),
• FPPS(BBa_K5181005).

Iz teh so sestavili svojo biokocko araBAD_SaSSy-FPPS (BBa_K5181014), ki so jo nato pomnožili s PCR. Biokocka je zasnovana tako, da se lahko uporablja skupaj z ogrodjem pSEVA, ki ima restrikcijski mesti EcoRI in HindIII. Uporabili so ogrodje pSEVA531 in plazmid ter insert rezali z restrikcijskima encimoma EcoRI-HF in HindIII. Ligacijo so izvedli z NEB T4 DNA ligazo uspešnost pa preverili z rezanjem z omenjenima restrikcijskima encimoma in gelsko elektroforezo. Nato so transformirali bakterije s plazmidom in potrdili sposobnost encimov za tvorbo santalena z GC/MS.

Načrtovanje konstrukta za izražanje P450-CPR

Zadnji cilj skupine IISER-TVM je bil zasnovati najustreznejši konstrukt za izražanje encimov P450 in CPR. Encima katalizirata pretvorbo santalena v santalol, ki je še zadnja od glavnih komponent olja sandalovine. Izražanje teh encimov v prokariontskih sistemih je velik izziv, s katerim se trenutno soočajo številni znanstveniki po svetu. Med glavnimi težavami pri izražanju rastlinskega, v membrano vezanega, citokroma P450 v prokariontih, so razlike v sestavi membran, nepravilno sidranje encimov in pomanjkanje optimalnih pogojev za izražanje v bakterijskih gostiteljih. Njihova rešitev je vključevala kombinacijo eksperimentalnega in računalniškega pristopa. S pregledom literature so ugotovili, da ima tudi P. putida svoj P450 encim, ki je dobro preučen. Njegovo strukturo so primerjali s tisto od rastlinega encima in zaznali precejšnjo strukturno podobnost, čeprav si sekvenci med seboj nista bili zelo podobni. Za tem so začeli s spreminjanjem uporabljenih rastlinskih encimov, s tem da so odstranili njuni transmembranski domeni. Kmalu pa so naleteli na novo težavo in sicer, da morata biti encima za pravilno delovanje blizu drug drugega. Pri reševanje tega izziva so si pomagali s strukturo še enega encima P450, tokrat iz bakterije Bacillus cereus. Ta encim je imel že vključeni obe domeni, oksidazno in reduktazno, strukturno pa je bil zelo podoben rastlinskima encimoma brez njunih transmembranskih domen. Člen, ki je povezoval oksidazno in reduktazno domeno v encimu iz bakterije B. cereus, so uporabili kot povezovalni člen pri svojem proteinu in z njim povezali rastlinska encima P450 in CPR1. Tako dobljen encim so poimenovali pP450. Za izražanje tega encima, so iz osnovnih delov sestavili novo biokocko tet-P450-CPR_fusion protein (BBa_K5181015). Zgrajena je bila iz:

• tet_RBS (BBa_K5181009),
• P450-CPR_fusion protein (BC_linker) (BBa_K5181008).

Kljub večim poskusom so imeli težave pri uspešni ligaciji vektorja in inserta tako z uporabo konvencionalne metode kot tudi z Gibsonovo metodo. Ligacijske poskuse so izvedli z različnimi vektorskimi ogrodji, vendar transformacije vseeno niso privedle do nastanka kolonij po elektroporaciji ali pa so transformirane kolonije, ki so jih izbrali in jim izolirali plazmide, na gelu pokazale le zabrisane lise. Da bi prišli do vzroka težav, so sekvencirali fragmente inserta, ki sodelujo pri povezavi z vektorjem. Na podlagi rezultatov so domnevali, da se fragment med PCR-jem sicer pravilno pomnoži, vendar ligacija ne uspe zaradi strukturnih težav ali pa težav s sekvencami.

Računalniško modeliranje

Kljub neuspelemu izražanju je skupina želela razumeti, kako bi dizajniran encim deloval. Z modeliranjem so raziskali vezavo santalena in njegovih derivatov na načrtovane P450-CPR encime ter analizirali učinkovitost te vezave preko energij vezave. Rezultati računalniških simulacij so pokazali ugodne interakcije med santalenom in P450-CPR kompleksom, kar nakazuje na potencialno učinkovito pretvorbo santalena v želen produkt santalol.

Viri in literatura

[1] PETal: Valorizing PET plastic to sandalwood oil https://2024.igem.wiki/iiser-tvm/home (pridobljeno 6. 4. 2025)

[2] J. Perez-Gil, J. Behrendorff, A. Douw, C. E. Vickers: The methylerythritol phosphate pathway as an oxidative stress sense and response system. Nat Commun 2024, 15, 5303.