Priprava Nicotiane benthamiane za proizvodnjo krisoeriola z uporabo tehnik sintezne biologije

Izhodiščni članek: Engineering Nicotiana benthamiana for chrysoeriol production using synthetic biology approaches

Uvod

Krisoeriol je 3'-O-metoksi flavon in spada v skupino naravnih polifenolnih spojin imenovanih flavonoidi. Ti se v rastlinah sintetizirajo kot sekundarni metaboliti, rastlinam dajejo barvo, vonj, jih ščitijo pred UV žarki in patogeni ter lahko privabljajo opraševalce. Flavonoidi imajo veliko bioloških aktivnosti, kot so protivnetne in protirakave lastnosti ter so dobri antioksidanti in se v ta namen uporabljajo v farmakološki industriji. V rastlinah se sintetizirajo v več tkivih, vendar v majhnih koncentracijah, kar lahko predstavlja problem pridobivanja flavonoidov na veliki skali. Kemična sinteza v laboratoriju v ta namen tudi ni primerna, saj so biosintezne poti nastanka flavonoidov dolge in pogosto kompleksne [1, 2].

Krisoeriol se sintetizira iz luteolina, pridobiva pa se ga lahko iz poljščin kot so lucerna, oljka, zelena, poper, mandarina, riž in druge. Biosintezna pot krisoeriola se začne s fenilalaninom in vključuje osem encimov in intermediatov do nastanka končnega produkta. Zaradi potreb po pridobivanju velikih količin izoliranih flavonoidov, raziskovalci iščejo tehnike iz področja sintezne biologije za povečanje koncentracij sintetiziranih sekundarnih metabolitov v rastlinah. V primeru krisoeriola so to poskusili s prehodnim izražanjem genov za encime biosintezne poti s pomočjo infilitracije z Agrobacterium tumefaciens v rastlini Nicotiana benthamiana [1].

Z Agrobacterium povzročeno prehodno izražanje v N. benthamiana

Raziskovalci so predpostavili, da lahko povečajo učinkovitost sočasnega izražanja več genov, v kolikor nosi vektor za transformacijo le ključne gene za encime v biosintezni poti. Biosintezno pot krisoeriola so uspešno skrajšali na samo štiri korake z izražanjem zapisov za pet encimov, kar je zmanjšalo samo velikost vektorja za transformacijo in s tem povečalo učinkovitost celotnega postopka. Sočasno izražanje zapisov za fenilalanin amonijak liazo in kalkon sintazo pretvori fenilalanin v naringenin. V drugem koraku flavon sintaza katalizira pretvorbo naringenina v apigenin, slednjega flavonoid 3'-hidrokislaza pretvori v luteolin in v zadnjem koraku se ta s pomočjo O-metiltransferaze pretvori v končni produkt krisoeriol. Zapise za posamezne encime so vzeli iz drugih rastlin in jih optimizirali za namen izražanja v N. benthamiana. Optimizirane zapise so najprej posamično testirali, tako da so celice A. tumefaciens transformirali z zapisi, celice nagojili ter z njimi infilitrirali liste N. benthamiane, pet dni po infiltraciji pa so dodali tudi substrat v koraku biosinteze, ki ga je testiran encim potreboval za delovanje. Liste so odvzeli šest dni po agroinfiltraciji in iz njih izolirali RNA ter krisoeriol aglikone. Analiza RNA z RT-qPCR je pokazala povečano raven izražanja vseh testiranih zapisov, v primerjavi z kontrolnimi vzorci listov, ki so bili infiltrirani s celicam A. tumefaciens, ki so vsebovale prazen plazmid. Ker N. benthamiana sama po sebi ne proizvaja krisoeriola v kontrolnih listih, ki niso vsebovali tarčnih genov tako niso zaznali izraženih genov. Izolirane krisoeriol aglikone so testirali z metodo HPLC in tudi tu so zaznali vsebnost posameznih intermediatov, v kontrolnih listih pa pri istih retencijskih časih ni bilo vrhov, ki bi nakazovali na prisotnost aglikonov [1].

Ko so s testiranjem našli optimalnih pet zapisov za željene encime, so jih sestavili skupaj v en binarni plazmid, v eno T-DNA regijo in preverili ali je uspešno tudi sočasno izražanje vseh petih encimov. Le to so preverili na enak način kot izražanje posameznih encimov, tako da so infilitrirali liste s celicami A. tumefaciens, ki so vsebovale plazmid. Z RT-qPCR so zaznali stabilno izražanje vseh 5 zapisov za encime. Kromatogram HPLC analize flavonoidov je vseboval vrh pri 350 nm pri retencijskem času 27,3 min, kar so kvalitativno enačili z kromatogramom standarda krisoeriola in s tem potrdili vsebnost krisoeriola v listih. Rezultate prisotnosti krisoeriola so dodatno še potrdili z UV spektroskopijo in z masnim spektrometrom ter določili vsebnost krisoeriol-7-O-glikozida ter krisoeriol-7-O(6'-malonil)glukozida, ki sta obliki v katerih se krisoeriol sintetizira v rastlinah. Kvantitativna analiza kromatograma pa je pokazala vsebnost krisoeriola pri 37,2 µg/g suhe teže listov. Vsebnost je višja v primerjavi s poskusom hkratne transformacije A. tumefaciens z več vektorji, kjer je vsak nosil zapis za samo en encim v biosintezi. V takem primeru so po analizi izmerili samo 4,3 µg/g suhe teže listov krisoeriola [1].

Optimalni pogoji za proizvodnjo krisoeriola

V namen optimizacije proizvodnje krisoeriola so raziskovalci preverili vpliv gostote celic A. tumefaciens in časa inkubacije po agroinfiltraciji na količino krisoeriola v listih rastline. Celice so gojili do različnih vrednosti OD600 v razponu od 0,4 do 2,0 in jih nato injicirali v liste rastline. Ugotovili so da sama gostota celic ni pretirano vplivala na proizvodnjo krisoeriola. V naslednjem koraku so liste infiltrirali s celicam pri OD600 vrednosti 0,8 ter podaljševali čas inkubacije do odvzetja vzorcev za nadaljnje testiranje. Izkazalo se je da se je sintetiziralo največ krisoeriola v listih, ki so jih odvzeli 10 dni po agroinfiltraciji. Koncentracija krisoeriola je dosegla 69,7 µg/g suhe teže listov [1].

Prehodno in stabilno izražanje

Primerjali so tudi vpliv prehodnega izražanja zapisov s stabilnim izražanjem na učinkovitost proizvodnje krisoeriola v rastlinah. V ta namen so v plazmid s tarčnimi encimi dodali zapis za odpornost proti herbicidu basta, nato pa so v rastlini Nicotiana tabacum listne diske inficirali z A. tumefaciens, ki so vsebovale ta plazmid in s tem dobili transgeni N. tabacum. Vsebnost krisoeriola so zaznali že v listih šest tednov starih rastlin prve generacije, v ne-transgenih rastlinah N. tabacum, ki se po videzu niso razlikovale od transgenih, niso zaznali krisoeriola. Nato so izbrali semena rastline, ki je po analizi vsebovala največ krisoeriola in vzgojili rastline druge generacije, ki so po kvantitativni in kvalitativni analizi vsebovale več krisoeriola kot prva generacija, vendar je bila vsebnost še vedno samo 12,6 µg/g suhe teže listov. Prav tako so opazili razlike v vsebnosti krisoeriola v mladih in odraslih listih šest tednov stare rastline, pri kateri je bila vsebnost krisoeriola v mladih listih 4,6-krat višja, kot v odraslih listih. Predpostavili so, da je krisoeriola v odraslih listih manj zaradi njegove razgradnje, ker ga naravno v N. tabacum ni ali ker se krioseriol in njegovi intermediati porabijo v drugih metabolnih poteh rastline. Vsebnost krisoeriola v mladih listih je bila podobna vsebnosti v listih, pri katerih so uporabili prehodno izražanje. Izkazalo se je, da je za proizvodnjo krisoeriola bolj učinkovito prehodno izražanje v N. benthamiana, kjer je bila, vsebnost 5,5-krat višja kot v transgenih rastlinah N. tabacum, ne glede na starost listov [1].

Tako prehodno izražanje kot stabilno izražanje imata svoje prednosti in slabosti. Prehodno izražanje lahko pospeši proces proizvodnje z veliko produkta glede na pridobljeno biomaso in hkrati omogoči tudi gojenje na prostem. Slabost tega procesa je pogosta potreba po bolj kompleksni infrastrukturi za gojenje, kot gojenje transgenih rastlin. Postopek izbire učinkovitih transgenih linij rastlin pri stabilnem izražanju traja dlje, kot gojenje pri prehodnem, vendar ko se enkrat izbere prava, tudi transgene rastline proizvedejo velike količine željenega produkta. Izbira načina izražanja je odvisna od tarčne snovi proizvodnje in za namene proizvodnje krisoeriola so za bolj optimalno metodo izbrali prehodno izražanje [1].

Antioksidativna aktivnost krisoeriola

Antioksidativno aktivnost krisoeriola so preverili s testom DPPH, ki temelji na redukciji DPPH molekule z vodikom, ki ga prispeva antioksidant, s tem pa se spremni barva reakcijske raztopine, kateri so merili abosrbanco in s tem določili aktivnost [3]. Rezultati kontrolnih listov, ki niso vsebovali vektorja za prehodno izražanje, so pokazali 37,58% inhibicijo DPPH radikalov, inhibicija s strani krioseriola izoliranega iz infilitriranih listov pa je bila 50,45%. Vrednosti so preverili še s pozitivno kontrolo Trolox, analog vitamina E, ki je pokazala nekoliko nižjo inhibicijo DPPH radikalov in sicer 46,06%. Poleg tega testa so naredili še test TAC, ki meri oksidacijo bakra(II) v baker(I), kjer je bila prav tako zaznana višja antioksidativna aktivnost v listih s krisoeriolom kot v kontorli. Test ABTS je prav tako pokazal 1,7-krat višjo aktivnost pri ekstraktih iz listov s krisoeriolom [1].

Zaključek

V članku so raziskovalci predstavili uspešno, na novo sestavljeno biosintezno pot krisoeriola v rastlinah, ki brez dodanih zunanjih substratov poveča proizvodnjo krisoeriola v N. benthamiani. Z Agrobacterium tumefaciens povzročenim prehodnim izražanjem ključnih genov za encim v biosintezni poti jim je uspelo proizvesti do 69,78 µg/g suhe teže listov krisoeriola, kar je 23-krat več kot ga naravno proizvede rjavi riž [1].

Literatura

[1] S. B. Lee, S. Lee, H. Lee, J.-S. Kim, H. Choi, S. Lee, B.-G. Kim: Engineering Nicotiana benthamiana for chrysoeriol production using synthetic biology approaches. Front. Plant Sci. 2024, 15, 1458916.

[2] A. N. Panche, A. D. Diwan, S. R. Chandra: Flavonoids: an overview. J. Nutr. Sci. 2016, 5, e47.

[3] S. B. Kedare, R. P. Singh: Genesis and development of DPPH method of antioxidant assay. J. Food Sci. Technol. 2011, 48, 412–422.