Priprava Pichie pastoris, ki učinkovito uporablja ksilozo, za industrijsko proizvodnjo encimov

From Wiki FKKT

Jump to: navigation, search

Contents

Uvod

Uporaba celulozne biomase kot obnovljive surovine za mikrobno pridelavo biogoriv, etanola, organskih kislin in tudi encimov postaja vedno bolj aktualna. Pomembna sestavina celulozne biomase je ksiloza, ki jo nekateri organizmi s pretvorbo v ksilulozo-5-fosfat (X5P) lahko vključijo v pentoza-fosfatno pot (PPP) ter tako uporabijo v nadaljnih metabolnih procesih. Večina industrijsko pomembnih vrst mikroorganizmov ksiloze ne more učinkovito vključiti v metabolizem. Mnoge raziskave se zato usmerjajo v pripravo novih sevov, sposobnih pretvorbe ksiloze v biogoriva in uporabne kemijske spojine. Avtorji članka so prvi opisali vnos metabolne poti za pretvorbo ksiloze v ekspresijski sistem, z namenom pridobivanja industrijsko pomembnih encimov. Kot modelni organizem so izbrali Pichio pastoris, enega najpomembnejših prozivajalcev encimov, ki pa ksiloze ne more učinkovito uporabljati za izgradnjo lastne biomase.

Namen

Priprava transgene P. pastoris, ki bi ksilozo učinkovito vključevala v PPP ter jo tako izkoriščala za sintezo proteinov.

Potek dela in rezultati

V raziskavi so naprej preverili, ali lahko P. pastoris (sev GS115) ksilozo uporablja kot edini vir ogljika. Celice so gojili na kompleksnem gojišču brez vira ogljika in enakem gojišču z dodano ksilozo. V prisotnosti ksiloze je bil čas celične rasti sicer daljši, vendar je bila rast počasna (podvojevalni čas ≈ 92 h). Pregled genoma GS115 je pokazal prisotnost domnevnih genov za NADPH-odvisno ksiloza reduktazo (XR) in NAD+-odvisno ksilitol dehidrogenazo (XDH), ki pri nekaterih vrstah kvasovk pretvarjata ksilozo v ksilulozo (oksidoreduktazna pot). Ksilulozo v X5P pretvarja ksilulokinaza (XK). Kljub prisotnosti genov, oksidoreduktazna pot pri P. pastoris očitno ni dobro razvita.

V celice GS115 zato vnesli gen za ksilozo izomerazo (XI) iz gliv rodu Orpinomyces. XI pretvarja ksilozo v ksilulozo direktno, se tako izogne stranskim produktom in bolje ohranja ravnovesje kofaktorjev. Dodatno so vnesli tudi gen za XK, da bi povečali njegovo izražanje.

Pripravili so rekombinantna vektorja pGAPZ-XI-His, z vnešenim genom XI, in pGAPZ-XK, z vnešenim genom XK. Gena sta bila v obeh vektorjih pod kontrolo močnega konstitutivnega promotorja GAPDH iz P. pastoris. Celice GS115 so transformirali z vsakim plazmidom posebej ali z obema hkrati. Dobljene seve GS-XI, GS-XK in GS-XI-XK so gojili v stresalnih posodah ter opazovali celično rast in porabo ksiloze v gojišču med fermentacijo. Kljub temu, da so celice uspešno izražale oba gena, se celična rast in poraba ksiloze glede na GS115 nista bistveno povečali.

Celice so zato na vnešeno metabolno pot poskusili prilagoditi z laboratorijsko evolucijo. Z metodo zaporednega serijskega gojenja so po 50-ih generacijah pridobili evolvirane seve: GS115SB50, GS-XISB50, GS-XI-XKSB50 in GS-XKSB50. Pri sevih GS115SB50, GS-XISB50 in GS-XKSB50 so opazili povečano hitrost celične rasti glede na sev GS115, pri podobni porabi ksiloze v gojišču (49-odstotno povečanje za GS115SB50, 80-odstotno za GS-XISB50 in 92-odstotno za GS-XKSB50). Z metodo qPCR v realnem času so pri teh sevih potrdili tudi povišano raven transkripcije genov XI in XK. Obratno so pri sevu GS-XI-XKSB50 opazili povišano porabo ksiloze, pri približno enaki hitrosti celične rasti. S qPCR v realnem času so ugotovili povišano izražanje gena XDH, zato je možno, da je evolucija seva potekala v smeri razvoja oksidoreduktazne poti.

Sposobnost izkoriščanja ksiloze za sintezo encimov so preverili z vnosom gena za β-manazo v celice GS115 in GS-XISB50. S transformacijo s plazmidom pGAPKH-Sman so dobili seva GS-3Sman in GS-XI-3Sman. Celice so gojili na gojiščih z dodano glukozo ali ksilozo ter primerjali končno biomaso celic in količino pridobljene β-manaze. Pri gojenju na glukoznem gojišču med sevoma ni bilo velikih razlik, medtem ko se je končna biomasa celic GS-XI-3Sman glede na celice GS-3Sman na ksiloznem gojišču povečala za 126 %, količina pridobljene β-manaze pa za 57,5 %.

Zaključek

V raziskavi so z vnosom gena za XI, povišanjem izražanja XK in evolucijskim inženirstvom uspešno pripravili transgeni sev P. pastoris, ki ksilozo učinkovito vključuje v metabolizem in jo izrablja za sintezo proteinov. Rezultati predstavljajo velik napredek v razvoju sistemov za izkoriščanje celulozne biomase za pridelavo industrijskih encimov.

Personal tools