Proizvodnja protitumorskih protiteles s človeku kompatibilnim glikozilacijskim profilom v kulturah koreninskih laskov v ''Nicotiani benthamiani''

From Wiki FKKT

Jump to: navigation, search

Production of a tumor-targeting antibody with a human-compatible glycosylation profile in N. benthamiana hairy root cultures

Contents

Uvod

Dobra alternativa suspenzijam celičnih kultur so kulture koreninskih laskov, predvsem zaradi dobre časovne učinkovitosti pri vzpostavitvi genetsko stabilnih linij za izražanje proteinov, hitre tvorbe biomase in možnega povečevanja obsega proizvodnje. Do sedaj so v kulturah koreninskih laskov uspešno izrazili rekombinantne encime, komponente cepiv, monoklonska protitelesa in mikrobicide proti virusu HIV. V dotični študiji so si Italijanski znanstveniki kot cilj zadali izraziti protitumorsko monoklonsko protitelo H10 (mAb H10) v N. benthamiani s spremenjenim profilom glikoziliranja proteinov, ki je kompatibilen človeškemu. Gre za človeško protitelo, ki prepozna domeno C velike podenote s tumorji povezanega antigena, tenasceina (TNC). Protitelesa proti TNC, so že bila uspešno uporabljena za zdravljenje pacientov z akutno mieloidno levkemijo in metastatskim rakom dojke. Pri terapevtskih protitelesih je glikozilacija velikega pomena in ker imajo rastline drugačen profil glikozilacije proteinov kot človek, lahko to povzroči zaplete ob zdravljenju ljudi s proteini proizvedenimi v rastlinah. Znanstveniki so s številnimi študijami dokazali, da se lahko glikozilacijski profil rastlin modificira z uporabo RNA interference in tako naredili klone, ki ne izražajo ksiloze in fukoze (ΔXTFT). Do sedaj pa ni bilo znano, ali se lahko protitelesa s spremenjeno glikozilacijo izraža v kulturah koreninskih laskov.

Potek eksperimenta in rezultati

V študiji so spremljali različna načina izražanja mAb H10 v N. tabacum in v ΔXTFT N. benthamiani. Zapisa za težko in lahko verigo protitelesa so v celice vstavili z dvema rastlinskima vektorjema, bila pa sta pod kontrolo promotorja mozaičnega virusa cvetače (35S) in ojačevalcem prevajanja(Ω) iz mozaičnega virusa tobaka, terminator pa je bil iz gena za nopalin sintazo. Pred zapis je bil vstavljen signalni peptid za izražanje rekombinantnega proteina v zunajcelični prostor.

Tvorba rekombinantnih koreninskih laskov

Koreninske laske N. tabacum so pridobili tako, da so liste rastline, ki so že izražale lahko in težko verigo mAb H10, okužili z Agrobacterium rhizogenes. Koreninske laske ΔXTFT N. benthamiane pa tako, da so liste rastline okužili z mešano kulturo A. rhizogenes, v kateri je polovica bakterij nosila rastlinski vektor z zapisom za lahko, druga polovica pa težko verigo mAb H10. Kulture koreninskih laskov, ki so uspešno izražale celotna protitelesa so identificirali s prenosom Western. Izbrali so po en klon N. tabacum in N. benthamiane, ki je izražal največ mAb H10.

Izražanje mAb H10 v medij in njihova izolacija

Kulturi koreninskih laskov izbranih klonov so nacepili v sterilno gojišče, ki so ga nato stresali v temi. Po treh do štirih tednih gojenja, so izražanje mAb H10 v gojišče inducirali z dodatkom kalijevega nitrata, polivinilpirolidona (PVP) in 1-naftalenocetne kisline (NAA). Po treh dneh so ponovno dodali PVP in NAA in po nadaljnjih petih dneh je sledilo zbiranje produkta. Gojišče so prefiltrirali in odstranili biomaso. Medij so nato centrifugirali in supernatant ponovno filtrirali. Biomaso so homogenizirali in s podobnim postopkom izolirali protitelesa, ki so ostala v celicah. Protitelesa so kvantificirali s testom ELISA, pri katerem so na plošče imobilizirali antigen TNC. Ugotovili so, da se v gojišče izrazi približno 20 % celokupno proizvedenega mAb H10 v N. benthamiani in 35 % pri N. tabacum. Po čiščenju protiteles, izoliranih iz gojišča, z afinitetno kromatografijo, so avtorji zbrali 60 % izraženih protiteles, po čiščenju protiteles izoliranih iz biomase pa je bil izkoristek po čiščenju manjši (30 %).

Sklep in zaključek

Raziskovalci poročajo, da je za velik razpon v koncentracijah izraženih protiteles odgovorna vgraditev transgenov v naključna mesta v genomu. V raziskavi so dokazali, da je protitelesa s spremenjenim profilom glikozilacije mogoče izražati v kulturah koreninskih laskov in da ima to tudi nekatere prednosti, kot je npr. izražanje protiteles v medij. Ključna omejitev pa so izkoristki, ki so reda velikosti nekaj miligamov na liter gojišča, medtem sistemi izražanja v celih rastlinah omogočajo izkoristke, ki dosegajo več sto miligramov na kilogram biomase. Kot navajajo, bo cilj nadaljnjih raziskav usmerjen v izboljšanje izkoristka.

Personal tools