Robustno večcelično računanje z uporabo gensko kodiranih vrat NE-ALI in kemičnih 'žic'

From Wiki FKKT

Jump to: navigation, search

Izhodiščni članek:[1]

Contents

Povzetek

Izračun temelji na organizaciji celic v strukturah višjega reda, na primer med razvojem ali prostorsko združitvijo bakterij v biofilmu. Vsaka celica izvaja enostavno računalniško operacijo, vendar se s komunikacijo med celicami pojavijo zapleteni vzorci. Tu preučujemo ta postopek s kombiniranjem preprostega genetskega vezja z zaznavanjem gostote celic za izdelavo kompleksnejših izračunov v prostoru. V Escherichia coli konstruiramo preprosta logična vrata NOR z ureditvijo dveh tandemskih promotorjev, ki delujeta kot vhoda za pogon transkripcije represorja. Represor inaktivira promotor, ki služi kot izhod. Posamezne kolonije E. coli imajo enaka vrata NOR, vendar so vhodi in izhodi priključeni na različne ortogonalne naprave za zaznavanje gostote. Izhodne molekule tvorijo žice med izhodom prve celice in vhodom druge celice. Z razporeditvijo kolonij v različnih prostorskih konfiguracijah se lahko ustvarijo komplicirana vezja.

Glavno

Booleova logična vrata integrirajo več digitalnih vhodov v en digitalni izhod. V celicah regulatorna omrežja kodirajo logične operacije, ki integrirajo okoliške in celične signale. Najpogosteje so celični signali izraženi geni. Zgrajena so sintetična genska logična vrata, vključno s tistimi, ki opravljajo funkcije IN, ALI in NE in so bila uporabljena v farmacevtskih in biotehnoloških aplikacijah. Za gradnjo bolj zapletenih programov je mogoče uporabiti več vhodna vrata vendar je težko predvideti, kako se bo obnašala kombinacija vezij na podlagi različnih vhodov. Tu so razdelili preprosta logična vrata v ločene seve E. coli in uporabili signalizacijo s pomočjo zaznavanja gostote, da bi omogočili komunikacijo med sevi. V članku sta kot vhodna signala uporabljena gena pod promotorjema PBAD in PTet in gen pod vplivom tandema teh dveh promotorjev. PBAD se aktivira v prisotnosti v arabinoze (Ara). Ptet pa se aktivira v prisotnosti anhidrotetraciklina (aTc).

Slika 1[2]: Genetska vrata NE-ALI. A - grafični prikaz operatorja NE-ALI (NOR) in resničnostna oz. pravilnostna tabela, ki prikazuje pravilnost izhodnih signalov za dane kombinacije vhodnih signalov. B - delovanje vrat NE-ALI. Če sta oba vhodna signala 0, bo izhodni 1 zaradi funkcije NE, ki naredi ravno obratno kot bi drugače pričakovali. C - zgornja slika-prikaz delovanja vrat ALI pod promotorjema P BAD in P Tet, čigar delovanje so merili s pomočjo fluorescence. Srednja slika – prikaz delovanja vrat ALI pod vplivom tandemskega promotorja P BAD –P Tet. Delovanje so merili s pomočjo pretočne citometrije. Z večanjem koncentracije induktorjev, se je fluorescenca višala, kar se sklada z delovanjem vrat ALI. Spodnja slika- prikaz delovanja vrat NE-ALI pod vplivom tandemskega promotorja P BAD –P Tet. Delovanje so merili s pomočjo pretočne citometrije. Z večanjem koncentracije induktorjev, se je fluorescenca manjšala, kar se sklada z delovanjem vrat NE- ALI.

Za izvedbo logičnih vrat ALI in NE-ALI so preizkusili različne kombinacije promotorjev. Preizkušali so promotorski tandem P BAD –P Tet, ki ju inducirata arabinoza in anhidrotetraciklin. P BAD –P Las , ki ju inducirata arabinoza in 3OC12-HSL ( N-3-okso-dodekanoil-homoserin lakton), ter P Tet – P Las inducirana s anhidrotetraciklinom in 3OC12-HSL. Tandemske funkcije teh promotorjev, so testirali s pomočjo dveh logičnih vrat. Iz poskusov so ugotovili, da en promotorski tandem P BAD –P Tet ni deloval po predvidevanjih. Predvidevajo, da je to posledica motenj, ki so odvisne od položaja promotorjev, učinka veriženja DNA, okluzije mest, ki vežejo transkripcijske faktorje in od stabilnosti mRNA (slika 2 ).

Slika 2[3]: Rezultati poskusov z različnimi tandemi promotorjev in uporabljenimi logičnimi vrati ALI in NE-ALI. A - rezultati za logična vrata ALI. Ob straneh je zapisan promotorski tandem. Leva fotografija prikazuje dobljene meritve, desna pa pričakovane. Meritve so bile izvedene s pomočjo merjenja fluorescence. B - rezultati za logična vrata NE - ALI. Ob straneh je zapisan promotorski tandem. Leva fotografija prikazuje dobljene meritve, desna pa pričakovane. Meritve so bile izvedene s pomočjo merjenja fluorescence.

V vsaki celici E. coli so kodirana logična vrata, ki pa se med seboj razlikujejo. Kot celične žice se uporablja signal za acil homoserin lakton (AHL) in le ta povezuje posamična logična vrata med seboj. Sintetiziran AHL, kot izhodna molekula logičnih vrat difundira skozi celično membrano in se veže na promotor LasI ali RhlI kot transkripcijski faktor. Ta dva promotorja pa služita kot vhoda za logična vrata v naslednji celici (slika 3a). Logična vrata XOR oz. Izključujoča vrata ALI, so zgrajena iz treh NE- ALI vrat in varovalnih vrat (slika 3a). Izhodni signal dobimo le, če imamo vsaj en vhodni signal. Vsaka logična vrata so v svoji celici in zato je pomembno, da so celice na agarni plošči v pravilni prostorski ureditvi za pravilno delovanje vezja (slika 3b).

Slika 3[4]: Konstrukcija vrat XOR s prikazano komunikacijo med kolonijami na plošči. A - štiri celice, vsaka s svojimi logičnimi vrati. V celici 1, sta vhodna signala arabinoza in anhidrotetraciklin. Izhodni signal pa LasI, ki omogoča povezavo s celico 2 in 3 s pomočjo 3OC12-HSL (N-3-okso-dodekanoil-homoserin lakton). V celici 2 sta vhodna signala arabinoza in 3OC12-HSL, izhodni signal pa je C4-HSL (N -butiril-homoserin lakton). V celici 3 sta vhodna signala anhidrotetraciklin in 3OC12-HSL, izhodni signal pa je C4-HSL (N -butiril-homoserin lakton), ki pa ga prepoznava celica 4, ki služi kot varovalo in je povezana z rumenim fluorescenčnim proteinom, ki ga detektiramo. B ¬- prostorska razporeditev celic, za delujoče vezje. C - odziv posamičnih celic na dodane induktorje izmerjen s pomočjo fluorescence. D - rezultati merjenja s pretočno citometrijo. Sestavili so majhno knjižico različnih vezij, ki delujejo kot enostavna logična vrata in so večinoma sestavni del logičnih vrat XOR. Vsaka logična vrata prikazana na sliki 3 imajo dva vhoda. Poleg bolj poznanih logičnih vrat XOR, IN, NE-IN (NAND), NE-ALI se pojavijo še EQUAL, IMPLY in NIMPLY.

Slika 4: Konstrukcija vseh 16 dvo-vhodnih logičnih vrat. A - knjižica enostavnih logičnih vrat, ki so jih vnesli v različne celice. B - različne prostorske postavitve operatorjev, ki so prikazani pod točko a. Grafi prikazujejo rezultate pretočne citometrije, pri kateri so uporabili različne induktorje.

Pravilnostne tabele za posamična logična vrata:

XOR oz. IZKLJUČUJOČA ALI vrata

Pozitiven izhodni signal dobimo, ko imamo le en vhodni signal enak 1. (tabela 1).

Tabela 1: Pravilnostna tabela XOR
A B Y
0 0 0
0 1 1
1 0 1
1 1 0

EQUAL

Izhodni signal je enak 1, le če sta vhodna signala enaka; torej oba 0 ali oba 1. (tabela 2).

Tabela 2: Pravilnostna tabela EQUAL
A B Y
0 0 1
0 1 0
1 0 0
1 1 1


IN

Izhodni signal je enak 1, le če sta oba vhodna 1. (tabela 3).

Tabela 3: Pravilnostna tabela IN
A B Y
0 0 0
0 1 0
1 0 0
1 1 1


NE-IN

Izhodni signal je vedno 1, razen v primeru, ko sta oba vhodna signala 1. (tabela 4).

Tabela 4: Pravilnostna tabela NE-IN
A B Y
0 0 1
0 1 1
1 0 1
1 1 0


ALI

Izhodni signal je enak 1, če je vsaj eden od vhodnih signalov 1. V primeru, da sta oba vhodna signala 1 je tudi izhodni signal enak 1. (tabela 5).

Tabela 5: Pravilnostna tabela ALI
A B Y
0 0 0
0 1 1
1 0 1
1 1 1

NE-ALI

Izhodni signal je enak 1 le, če sta oba vhodna enaka 0. (tabela 6).

Tabela 6: Pravilnostna tabela NE-ALI
A B Y
0 0 1
0 1 0
1 0 0
1 1 0

A IMPLY B

Če je samo vhodni signal B enak 1, potem je izhodni signal nak 0. V vseh ostalih primerih je izhodni signal enak 1. V primeru B IMPLY A pa imamo ravno obratno situacijo. V primeru ko imamo samo Vodni signal A enak 1, je izhodni signal 0. V vseh ostalih primerih je izhodni signal 1. (tabela 7).

Tabela 7: Pravilnostna tabela A IMPLY B
A B Y
0 0 1
1 0 0
0 1 1
1 1 1

A NIMPLY B

Samo ko je vhodni signal A prisoten in je odsoten vhodni signal B ima izhodni signal vrednost 1. Pri B NIMPLY A pa imamo ravno obratno situacijo. Samo v prisotnosti vhodnega signala B je izhodni signal enak 1. (tabela 8).

Tabela 8: Pravilnostna tabela A NIMPLY B
A B Y
0 0 0
0 1 0
1 0 1
1 1 0


Izračuni so robustni glede na razdalje med kolonijami, časom in gostoto celic. Skupki celic, z različnimi logičnimi vrati prikazuje, kako se lahko celice z enostavnimi logičnimi vrati povežemo v zapletena vezja s pomočjo uporabe razpršenih kemijskih signalov. Ta načela lahko uporabimo pri inženiringu bioloških sistemov za ustvarjanje vse bolj zapletenih funkcij.

Literatura

Tamsir, A., Tabor, J. J. & Voigt, C. A. Robust multicellular computing using genetically encoded NOR gates and chemical ‘wiresg’. Nature 469, 212–215 (2011).

Personal tools