Sintetična logična vezja in spomin v živih celicah

From Wiki FKKT

Jump to: navigation, search

Privzeto po članku: P.Siuti, J. Yazbek in T. K Lu; Synthetic circuits integrating logic and memory in living cells; Nat. Biotechnol., vol. 31, no. 5, (448–452)

Logične funkcije in spomin so esencialne funkcije vezji, da se lahko le-ta odzovejo na določeno stanje oz. dogodek. Pri tej raziskavi so uporabili dve ortagonalni rekombinazi za implementacijo Boolovih logičnih funkcij v stabilno DNA, v katero se zapišejo dogodki, kar deluje kot spomin. Na ta način so v celicah E. coli naredili šestnajst Boolovih logičnih funkcij, ki se odzivajo na dva vhodna signala. Pri vsaki funkciji so uporabili le ena logična vrata. Odgovor so pridobili s pomočjo reporterskega gena zelen fluorescirajoči protein (GFP) ali analize PCR. S pomočjo tega sistema bi lahko v prihodnosti zasnovali na celicah osnovane kompleksne sisteme, stroje, ki bi se odzivali na stanja oz. dogodke. Ti bi nam pomagali pri terapevtiki, diagnostiki, imeli pa bi tudi znanstvene aplikacije [1].

Contents

Opis sistema

Sistem funkcij so sestavili tako, da so s pomočjo dveh vhodnih signalov A in B inducirali izražanje dveh ortagonalnih rekombinaz, ki se izražata odvisno od inducibilnega promotorja. Ti dve rekombinazi sta specifični, kar pomeni, da obrneta zaporedje DNA, ki leži med kratkima zaporedjema, specifičnima za posamezno rekombinazo. Povzročita torej inverzijo določenega gena, terminatorja ali promotorja. Sestavili so plazmide, ki bodo s pomočjo vhodnih signalov A in B dali odgovor za specifično funkcjo. Prvim jim je uspelo tudi povezati logične funkcije s spominom in tako so uspeli shraniti informacijo o stanju ali dogodku, in sicer so informacijo s pomočjo rekombinaz 'zapisali' v stabilno DNA, ki se v celicah množi in prenaša naprej [1]. Uporabili so dve serinski rekombinazi, Bxb1 in phiC31. Vsaka prepozna svoje specifično zaporedje DNA, attB in attP. Ti dve irreverzibilno obrneta del zaporedja DNA, ki leži med zaporedjem attB in attP, specifičnima za posamezno rekombinazo [2]. Zapisa za rekombinazi so sklonirali za inducibilni riboregulator, da bi preprečili izražanje rekombinaz v odsotnosti vhodnih signalov. Pred zapisom za rekombinazo Bxb1 stoji N-acil homoserin laktonski (AHL) riboregulator, pred phiC31 pa anhidrotetraciklinski (aTc) riboreulator. Ta sta vsebovala vse celice in so se tako lahko odzivale na signala A, ki je bil N-acetil homoserin lakton, in B, anhidrotetraciklin. Kot reporter je bil uporabljen GFP [1]. Funkcije so bile ločene po celicah. Konstrukte so skupaj sestavili z metodo Gibsonove montaže, ki je enostavna metoda kloniranja [3]. Določeno funkcijo definirajo samo pozicije, orientacije in kombinacije promotorjev, terminatorjev in reporterskega gena, ter seveda položaj zaporedji na katere delujeta rekombinazi. Za izražanje reporterskega gena potrebujemo promotor, gen in terminator, v tem vrstnem redu [1].

Funkcije

Funkciji ALI in NE-IN so zasnovali tako, da so naredili kaskado dveh promotorjev. Pri ALI sta bila v začetnem stanju obrnjena protismerno genu GFP. Tako v prisotnosti signala A ali B poteka prepisovanje GFP. GFP se je torej izražal, ko je bil prisoten posamezni signal ali pa oba, saj sta oba signala inducirala izražanje rekombinaze, ki je povzročila inverzijo promotorja. Pri NE-IN pa je bilo ravno obratno, promotorja sta bila obrnjena v isto smer kot GFP, torej se je GFP izražal ob posameznem signalu ali brez njega [1]. Funkciji IN in NE-ALI so zasnovali s kaskado dveh terminatorjev med promotorjem in genom za GFP. Pri funkciji IN sta terminatorja obrnjena v smeri GFP, kar pomeni, da se GFP izraža le, ko sta prisotna oba signala in sta oba terminatorja obrnjena protismerno ter tako ne vplivata na izražanje GFP. Pri funkciji NE-ALI pa sta terminatorja obrnjena v smeri promotorja, kar pomeni, da se izražanje GFP ustavi vsakič, ko je prisoten signal [1]. Iz NE-ALI in NE-IN se lahko v računalniškem svetu sestavi več bolj kompleksnih funkcij. V biološkem svetu pa je to lažje narediti na drugačen način. Vezje za vsako izmed šestnajstih Boolovih funkcij so zasnovali s sistemom v katerem so nastopali promotorji, terminatorji in reporterski gen pod vplivom rekombinaz [1]. Funkcijo B NE-IMPLIKACIJA A so zasnovali s kaskado protismerno obrnjenega promotorja, ki ga obrne rekombinaza phiC31 z vhodnim signalom B, in navzdol ležečim protismerno obrnjenim terminatorjem, ki ga obrne rekombinaza Bxb1 z vhodnim signalom A. Navzdol od teh dveh pa leži gen za GFP, ki se izraža le, ko je prisoten samo signal B, torej ko je A FALSE in B TRUE. Ob B signalu se izrazi rekombinaza phiC31, ki obrne promotor, kar povzroči izražanje GFP, saj je terminator protismerno obrnjen in tako ne vpliva na prepisovanje gena. Ob signalu A pa se izrazi rekombinaza Bxb1, ki obrne terminator, ta nato deluje tako, da ustavi izražanje GFP [1]. Funkciji EKSKLUZIVNI ALI in NE-EKSKLUZIVNI ALI so zasnovali po principu, da en člen, torej promotor ali reporterski gen, obdamo s prepoznavnimi sekvencami za obe rekombinazi v obliki sendviča. Pri funkciji EKSKLUZIVNI ALI so s prepoznavnimi sekvencami rekombinaz obdali protismerno orientiran promotor. Torej, če je prisoten posamičen katerikoli signal, potem se GFP izraža, saj rekombinaza, ki je posledica določenega signala, povzroči spremembo orientacije promotorja. Če pa signal ni prisoten ali pa sta prisotna oba, se GFP ne izraža, saj se orientacija dvakrat spremeni, torej pristane nazaj v prvotnem stanju. Pri funkciji NE-EKSKLUZIVNI ALI so s prepoznavnimi zaporedji rekombinaz obdali gen za GFP, ki ima prvotno smerno orientacijo. Torej ob prisotnem posamičnem signalu določena rekombinaza obrne zaporedje gena in GFP se preneha izražati. V primeru ko ni prisoten noben signal, se GFP izraža, enako je takrat, ko sta prisotna signala A in B, saj se v tem primeru zaporedje za GFP obrne in pristane v prvotni orientaciji [1]. Analiza sistema in rezultatov Katere elemente so uporabili v posameznih funkcijah, je odvisno seveda od logične funkcije, dolžine DNA, saj ta vpliva na učinkovitost rekombinaz. Nekateri regulatorni elementi lahko puščajo, zato moremo izbrati ustrezen promotor, terminator in specifično zaporedje za rekombinazo. Poleg tega pa na učinkovitost vezja vplivajo tudi elementi, ki niso nujno povezani z logičnimi vrati [1]. Odgovor funkcije na vhodne signale se shrani v DNA celice, izražanje oz. ne-izražanje reporterskega gena ostane fiksno tudi ko vhodni signali niso več prisotni. Testirali so tudi, kako dolgotrajna je ta informacija na funkciji AND. Po tretiranju skupine celic z obema signaloma, so te redčili in gojili. Ugotovili so, da se je informacija ohranila čez 90 generacij, ne da bi dodali signale [1]. Celice E. coli z vezjem NE-ALI, so lizirali in s pomočjo PCR detektirali stanje plazmida. Dodali so štiri različne olige v DNA lizatov različno tretiranih celic in analizirali PCR produkte. Prvi oligonukleotid (P1) se je prijel pred smerno obrnjen promotor, drugi (P2) za smerno obrnjen gen za GFP, tretji (P3) za protismerno obrnjen gen za GFP in četrti (P4) za protismerno obrnjen promotor. Rezultat P1:P2 dobimo v primeru brez vhodnih signalov, P1:P3 pri dodatku AHL, P4:P2 pri dodatku aTc in P4:P3 pri dodatku obeh [1].

Povezava analognega z digitalnim

Cilj je, da bi sestavili sintetična genetska programabilna vezja. Zato so zgradili tudi pretvornik digitalnega-v-analogno, ki digitalno induciran signal pretvori v stabilno gensko izražanje izhodnega signala. Torej lahko dva inducibilna signala pretvori v štiri različne odgovore, značilne za posamezno funkcijo. Uporabili so tri različne konstitutivne promotorje z različnimi nivoji izražanja. Testirali so nivoje izražanja teh promotorjev s skladnimi pretvorniki, pri tem so gledali izražanje GFP preko vezja s pretočno citometrijo. Rezultati so pokazali, da je phiC31 attB zaporedje zmanjšalo nivo izražanja GFP pri vseh promotorjih v primerjavi z Bxb1 attB zaporedjem in primerom brez takega zaporedja. Nivo izražanja GFP, ko sta prisotna oba signala, je enak seštevku izražanja prisotnosti posameznih signalov. Nivoje izražanja posamezne rekombinaze lahko fiksiramo z določenim inducibilnim pormotorjem. Tako dobimo različne nivoje izražanja GFP ob prisotnosti posameznih signalov in lahko iz intenzitete fluorescence zaznamo odgovor vezja [1].

Zaključek

Zamislili so si zanimiv sistem, v katerem nastopata konstitutivni in inducibilni promotor, ter tako dobili učinkovito regulacijo izražanja, kar doprinese k razvoju tega področja. Sestavili so tudi pretvornik digitalnega-v-analogno, s pomočjo katerega so vezja s prej naštetimi promotorji lahko programabilna. Celice E. coli si odgovore vezji tudi 'zapomnijo', rekombinaze jih 'zapišejo' v DNA. Podoben sistem bi lahko aplicirali tudi na kompleksnejše organizme. Lahko bi vključili bakteriofage kot prenašalce informacij v obliki DNA. Ker celice hranijo svoje odgovore, bi lahko zasnovali tudi biološke naprave. Vsebovale bi v bistvu celične senzorje z logičnim vezjem in spominom. Lahko bi nam mogoče uspelo narediti tudi celice z reverzibilnim z rekombinazami posredovanim spominom. Tako bi zgradili naprave za diagnostiko, terapevtiko in z aplikacijo v znanosti. Uspelo jim je že narediti napravo za klinično diagnostiko biomarkerjev [1], [2].

Viri

[1] P. Siuti, J. Yazbek, and T. K. Lu, “Synthetic circuits integrating logic and memory in living cells,” Nat. Biotechnol., vol. 31, no. 5, pp. 448–452, May 2013.

[2] T.-Y. Chiu and J.-H. R. Jiang, “Logic Synthesis of Recombinase-Based Genetic Circuits,” bioRxiv, p. 088930, Nov. 2016.

[3] “Gibson Assembly® Cloning Kit | NEB.” [Online]. Available: [Information]. [Accessed: 21-May-2020].

Personal tools