Sintezna biologija in biomimetika pri razvoju biosenzorjev

From Wiki FKKT

Jump to: navigation, search

Contents

Uvod

Biosenzor je analitična naprava, ki zaznava prisotnost analita in združuje biološke komponente s fiziokemičnim detektorjem. Glavni cilji razvoja naslednje generacije biosenzorjev so predvsem zniževanje pragu detekcije, večja stabilnost ter selektivnost ter kontinuirana analiza kompleksnih snovi, pri čemer lahko veliko pripomore sintezna biologija, saj omogoča ustvarjanje novih ali pa modifikacijo že obstoječih biosenzorjev v smeri pridobivanja želenih lastnosti. Vzpon novih tehnologij omogoča izkoriščanje modificiranih organizmov, ki se specifično odzivajo na dražljaje iz okolja (npr. polutante) ali pa osnovanje novih molekul na osnovi bioloških, kot so peptidomimetiki, MIP (molekulsko vtisnjeni polimeri) in aptameri, ki nudijo npr. boljšo specifičnost ali stabilnost v biosenzorju. V zdravstvu se biosenzorje uporablja za zaznavanje bolezenskih anomalij, v okoljevarstvu in prehrani za zaznavanje polutantov v vodi in hrani, potencialno bi lahko zaznavali prisotnost kemikalij v eksplozivih ipd. V nadaljevanju bodo predstavljeni primeri uporabe novih pristopov pri izgradnji biosenzorjev (Scognamiglio, Antonacci, Maya, Litescu, & Rea, 2015).


Celični biosenzorji

Uporaba celičnih biosenzorjev je omejena, predvsem je težaven kratek rok uporabe. Sintenični celični biosenzorji postajajo vse bolj občutljivi, v primerjavi s konvencionalnimi metodami pa so tudi hitreje odzivni. Delujejo tako, da preko sintetično ustvarjenega vezja, ki je občutljivo na analit, izražajo reporterski protein, ki ga z različnimi metodami zaznamo. Eno najbolj uporabljenih vezij je RecA-LexA (proteina sodelujeta pri SOS odzivu na mutacije), ki se v E. coli uporablja pri testu genotoksičnosti. Pod kontrolo promotorja SOS box, ki kontrolira izražanje genov, ki sodelujejo pri odzivu SOS, dodamo še gen LacZ, ki je reporterski protein in tako merimo intenzivnost mutacij (v odvisnosti od UV ali kemikalij). Izziv za razvoj biosenzorjev je tudi standardizacija. Na to se nanaša tudi velik šum v celičnem okolju. Velika medcelična variabilnost namreč ovira funkcionalnost sistema na ravni kolonije (Scognamiglio et al., 2015). Ta problem so rešili s sinhronizacijo oscilacije tisočih kolonij s hkratno uporabo močnega, vendar kratkosežnega medceličnega sistema za zaznavanje gostote (quorum sensing) znotraj kolonij, in šibkega, vendar dolgosežnega (in hitrega) redoks signaliziranja s H2O2 med kolonijami, ki je bilo sklopljeno s prvim in deluje kot dodatna povratna zanka. Gen za dehidrogenazo NADH II (NDH-2) so namreč vstavili pod kontrolo promotorja lux. Hlapi H2O2, ki nastanejo zaradi delovanja NDH-2, potujejo do sosednjih kolonij in po vstopu v celico spremenijo redoks stanje, kar preko nativnega kontrolnega odziva (inaktivacija proteina ArcAB) povzroči, da se promotor lux derepresira, to pa povzroči signaliziranje preko AHL. To signaliziranje spodbudi spet signaliziranje s H2O2 itn. Oscilacija v ravni AHL (in s tem reportersega proteina) pa je bila dosežena s tem, ko je gen aiiA represiral delovanje AHL, prepisovanje omenjenega gena pa je bilo regulirano ravno z AHL (Prindle et al., 2012). Z medicinskega vidika zanimiv biosenzor je biosenzor za zaznavanje in ubijanje Pseudomonas aeruginosa. E. coli zazna AHL, ki ga proizvaja Pseudomonas aeruginosa, začne proizvajati proteina S5 in E7. Pri pražni koncentraciji E7 pride do lize, sproščen S5 pa ubije patogeno bakterijo (Saeidi et al., 2014). Kot primer zaznavanja intracelularnih molekul lahko navedem rekombinantno Saccharomyces cerevisiae, ki zaznava v sebi asimilirano ksilozo s tem, ko se ksiloza veže na represor XylR, kar povzroči izražanje reporterskega proteina (Teo & Chang, 2014). Podobno so za zaznavanje metabolitov razvili tudi biosenzorje, ki so temeljili na RNA, npr. ribosomska stikala. Njihova prednost je možnost prilagajanja zaznavanja širokega nabora majhnih molekul z de novo sintezo RNA aptamerov. Večina biosenzorjev je narejena za optično detekcijo. Ti so primerni za in vivo merjenje in potrebujejo le preprosto inštrumentacijo. Zaradi robustnosti, visoke občutljivosti, zelo nizkega praga detekcije (tudi pri optično nečistih spojinah) in mnogih drugih prednosti pa delajo tudi elektrokemične biosenzorje. Primer samopoganjajočega elektrokemičnega senzorja je “ElectrEcoBlu”. Prepoznavni element v E. coli je transkripcijski aktivator XylR ali DntR, vsak veže določene polutante. Ob vezavi polutanta na transkripcijski faktor se aktivira sinteza dveh encimov, ki katalizirata nastanek piocianina, ta pa deluje kot mediator za prenos elektronov v mikrobiološki gorivni celici in s tem ustvarja električni tok (Gu et al., 2010). Tak biosenzor omogoča poceni in preprosto detekcijo analita v realnem času.

Uporaba umetnih liposomov

Liposome se zahvaljujoč možnosti združevanja strukturnih, kemijskih in amfifilnih lastnosti lipidnih membran z dosežki nanotehnologije na veliko uporablja kot umetne celice za biosenzorje. Naredili so mikrofluidni biosenzor za detekcijo patogenov. Prvo DNA prepoznavno zapordje so vezali na liposom, ki je imel enkapsulirana barvila, drugo pa na paramagnetne glavice. Ob prisotnosti tarčne RNA virusa denge pride do hibridizacije RNA na enem koncu s prvim zaporedjem in na drugem koncu z drugim zaporedjem. Kompleks liposom-tarča-glavica se pozneje ustavi na magnetu, koncentracija tarčne RNA pa se kvantificira s fluorescenčno mikroskopijo. Čas analize je kratek, zaradi ojačanja z mnogimi molekulami barvila znotraj enega liposoma pa ima ta senzor povečano občutljivost, prag je kar 100-krat nižji v primerjavi z membranskim biosenzorjem za virus denge (Kwakye & Baeumner, 2003). Podoben biosenzor bi bil lahko primeren za uporabo na terenu. V splošnem gledano celični biosenzorji bolje zaznavajo kemijsko in biološko okolje, vendar so lahko manj učinkoviti pri uporabi v težkih rastnih pogojih (Scognamiglio et al., 2015). Razvoj sintetičnih molekul Umetne molekule, pridobljene z organsko sintezo, ki uponašajo delovanje predvsem proteinov, kot so aptameri, biomimetiki, molekulsko vtisnjeni polimeri (MIP), peptidne nukleinske kisline (PNA) in ribocimi, imajo lastnosti, ki so zelo uporabne pri razvoju biosenzorjev.

Biomimetiki

Razvoj biosenzorjev, temelječih na proteinih kot spoznavnih elementih, je omejen z njihovo produkcijo in čiščenjem, velikim delom pri njihovem označevanju ter s podvrženostjo denaturaciji, pri čemer je stabilnost ključna za zaznavanje biosenzorjev. Biomimetični peptidi imajo mnogo prednosti. Ne potrebujejo naporne produkcije v velikem merilu in postopkov čiščenja, saj so lahko dostopni z avtomatsko kemijsko sintezo. Lahko nudijo bolj stabilno tridimenzionalno strukturo in so zato bolj robustni in primerni za dolgotrajno shranjevanje v suhih, raztopljenih in imobiliziranih oblikah. Naredili so senzor, katerega del je 18 aminokislin dolg peptid pTMVP, ki so ga funkcionalizirali z dvema različnima okoljsko občutljivima fluoroforoma z dvema linijema emisije. Ob vezavi Fab57P, rekombinantnega fragmenta protitelesa, pride do spremembe relativne intenzitete med emisijo normalne in emisijo tautomerne vzbujene species (Enander et al., 2008). Drug primer je uporaba peptidov za detekcijo protiteles proti virusu hepatitisa D med pacienti s površinsko plazmonsko resonanco (Scognamiglio et al., 2015).

Molekularno vtisnjeni polimeri (MIP)

In vitro diagnostika v biomedicini, prehranski industriji in okoljskih analizah temelji pretežno na uporabi protiteles. Kot že omenjeno, je njihova slabost zahtevna priprava oz. visoka cena in kratek rok trajanja oz. nestabilnost strukture v delovnih razmerah. Sintetične molekule, kot so MIP, ki uponašajo delovanje protiteles in imajo prednosti, kot so visoka termična in kemična odpornost, odpornost na encimsko razgradnjo in velika občutljivost, pri razvoju diagnostičnih orodij veliko obetajo. MIP-i so sintetični polimeri, ki vsebujejo spoznavno mesto za analit in jih odlikuje podobna vezavnost in specifičnost kot pri naravnih molekulah. Pripravi se jih s polimerizacijo funkcionalnih monomerov okoli matrične molekule, ki predstavlja tarčo. Po polimerizaciji se matrično molekulo odstrani in specifično spoznavno mesto je komplementarno tarči v velikosti, obliki in poziciji funkcionalnih skupin. Tako nastala sintetična molekula oponaša biološko aktivnost naravnega receptorja z ojačano specifičnostjo in stabilnostjo. Čeprav je priprava enastavna in poceni, je časovno potratna, pogosto pa je odstranjevanje matrice problematično. Narejeni so bili senzorji za zaznavanje kemikalij v tleh in vodi, herbicidov, težkih kovin ipd. Razvili so tudi senzor za zaznavanje humanega kardianega troponina (TnT), ki je občutljiv marker za miosrčni infarkt. Polimer je bil nanešen na zlato elektrodo, zaznavanje vezave pa se zaradi spremenjenega redoks obnašanja sonde na elektrodi spremljali elektrokemijsko (Karimian et al., 2013; Scognamiglio et al., 2015).


Aptameri

Aptameri so kratke nukleinskokislinske ali peptidne molekule, sintetizirane s kemijsko sintezo. Imajo visoko specifičnost, afiniteto, dolg rok trajanja, enostavno sintezo in možnost dodatne modifikacije. Za uporabo v biosenzorjih nudijo širok nabor analitov, od malih molekul do proteinov in celic. Za optično zaznavanje je pogosto uporabljen aptamer, ki ima fluorofor in dušilec. Vezava tarče spremeni strukturo tako, da sta fluorofor in dušilec v drugačni konformaciji kot prej, kar privede do razlike v fluorescenci. Slabost je ta, da pogosto pride do lažnih signalov zaradi interakcije z drugimi ligandi ali topilom. Razvili so biosenzor, ki sestoji iz ene verige aptamera, ki ima na vsakem koncu hibridizirana različna oligonukleotida, konca aptamera pa sta označena še s FRET parom. Če tarča (trombin) reagira z anti-trombinsko aptamerno verigo (oligonukleotid na koncu), se celoten konstrukt razpre, sicer je pa zvit. Od oddaljenosti med fluoroforoma, ki je odvisna od konformacije konstrukta, je odvisna fluorescenca. Če želimo detektirati drug analit, spiramo oligonukleotide s komplementarnimi, potem pa s hibridizacijo nanesemo nove – takšne, da se eden od njiju veže na analit (Buranachai, Thavarungkul, & Kanatharana, 2012). Razvili so tudi elektrokemijski senzor, pri katerem se elektroaktivni reporter konjugira ali kompleksira na aptamer. Ob prisotnosti analita se spremeni struktura aptamera tako, da prepreči stik med redoks reporterjem in elektrodo.


Peptidne nukleinske kisline (PNA)

Pri DNA oz. RNA senzorjih pogosto ostaja problem občutljivost, selektivnost in hitrost zaznavanja hibridizacije. Uporaba PNA sond v elektrokemijskih biosenzorjih je pokazala večjo občutljivost in specifičnost v primerjavi z DNA/RNA, hibridizacija je hitrejša in sonda potrebuje krajši odsek, encimatska razgradnja pa je težja.


Ribocimi

Napredek v inženiringu nukleinskih kislin odpira možnosti dizajniranja boljših preklopnih senzorjev (informacijo posreduje konformacijska sprememba zaznavnega elementa). Racionalen dizajn, usmerjena evolucija in procesi označevanja se integrirajo pri izdelavi sintetičnih ribocimov, RNA molekul, ki delujejo kot molekularna stikala, ki regulirajo in katalizirajo vrsto biokemijskih procesov (procesiranje tRNA, izrezovanje mRNA...). Z računalniškimi pristopi so naravne in sintetične ribocime ter ribosomska stikala (segment RNA, ki veže malo molekulo) preko vstavitve oligonukleotidnih sekvenc (aptamerov), ki regulirajo aktivnost ribocima z vezavo liganda, preuredili v alosterične ribocime (aptacime). Uporabljeni so bili kot biosenzorji za detekcijo majhnih analitov, neprimernih za teste s protitelesi, kvantifikacijo miRNA, virusne RNA itd (Scognamiglio et al., 2015).


Zaključek

Potencial biosenzorjev z razvojem sintezne biologije in nanotehnologije narašča. S tem se razvijajo diagnostična orodja na področjih od farmacije do okoljevarstva. Komercialnega razmaha zaenkrat še ni, predvsem na račun neobčutljivosti in nestabilnosti, poleg omenjenih ved pa v zadnjem času k razvoju biosenzorjem ogromno prispevata mikrofluidika in tehnologija grafena.

Viri:

1. Buranachai, C., Thavarungkul, P., & Kanatharana, P. (2012). A Novel Reconfigurable Optical Biosensor Based on DNA Aptamers and a DNA Molecular Beacon. Journal of Fluorescence, 22(6), 1617–1625. http://doi.org/10.1007/s10895-012-1105-6

2. Enander, K., Choulier, L., Olsson, a L., Yushchenko, D. a, Kanmert, D., Klymchenko, A. S., … Altschuh, D. (2008). A peptide-based, ratiometric biosensor construct for direct fluorescence detection of a protein analyte. Bioconjugate Chemistry, 19(9), 1864–70. http://doi.org/10.1021/bc800159d

3. Gu, X., Trybiło, M., Ramsay, S., Jensen, M., Fulton, R., Rosser, S., & Gilbert, D. (2010). Engineering a novel self-powering electrochemical biosensor. Systems and Synthetic Biology, 4(3), 203–14. http://doi.org/10.1007/s11693-010-9063-2

4. Karimian, N., Vagin, M., Zavar, M. H. A., Chamsaz, M., Turner, A. P. F., & Tiwari, A. (2013). An ultrasensitive molecularly-imprinted human cardiac troponin sensor. Biosensors and Bioelectronics, 50, 492–498. http://doi.org/10.1016/j.bios.2013.07.013

5. Kwakye, S., & Baeumner, A. (2003). A microfluidic biosensor based on nucleic acid sequence recognition. Analytical and Bioanalytical Chemistry, 376(7), 1062–1068. http://doi.org/10.1007/s00216-003-2063-2

6. Prindle, A., Samayoa, P., Razinkov, I., Danino, T., Tsimring, L. S., & Hasty, J. (2012). A sensing array of radically coupled genetic “biopixels”. Nature, 481(7379), 39–44. http://doi.org/10.1038/nature10722

7. Saeidi, N., Wong, C. K., Lo, T.-M., Nguyen, H. X., Ling, H., Leong, S. S. J., … Chang, M. W. (2014). Engineering microbes to sense and eradicate Pseudomonas aeruginosa, a human pathogen. Molecular Systems Biology, 7(1), 521–521. http://doi.org/10.1038/msb.2011.55

8. Scognamiglio, V., Antonacci, A., Maya, D., Litescu, S. C., & Rea, G. (2015). Author ’ s Accepted Manuscript. Biosensors and Bioelectronic. http://doi.org/10.1016/j.bios.2015.07.078

9. Teo, W. S., & Chang, M. W. (2014). Bacterial XylRs and synthetic promoters function as genetically encoded xylose biosensors in Saccharomyces cerevisiae. Biotechnology Journal, 1–23. http://doi.org/10.1002/biot.201400159

Personal tools