Visoko frekvenčna mutageneza na ne pravem mestu, ki jo inducirajo nukleaze sistema CRISPR-Cas v človeških celicah

From Wiki FKKT

(Redirected from User:Ufurar)
Jump to: navigation, search

Povzeto po članku High frequency off-target mutagenesis induced by CRISPR-Cas nucleases in human cells (dostopno na https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC3773023/)

Urška Furar


Contents

CRISPR Cas

Prvič je bil CRISPR (angl.: Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats) zaznan v bakterijah E. Coli. To so kratki palindromni segmenti DNA (20 – 40 bp), ki imajo enako zaporedje. Med njimi so vmesniki (angl.: spacer DNA), ki pa si med seboj niso identični. Ugotovili so, da so ti vmesniki komplementarni virusni oz. bakteriofagni DNA. Odkrili so tudi gene, povezane s CRISPR, t. i. CAS (angl.: CRISPR associated) geni. Vsebujejo zaporedja za proteine, večinoma helikaze in nukleaze.

CRISPR orodja so enostavno programirljiva za tarčenje katerega koli zaporedja v genomu. Uporabo omenjenih orodjih v terapevtske namene zahteva veliko natančnost, potrebno je tudi dobro razumevanje efektov/mutacij, ki se zgodijo na napačnih mestih (angl.: off-target effect), njihovih bioloških posledic in kako le-te lahko olajšamo. Uporabljeni so mnogi algoritmi, s katerimi lahko predvidimo ta mesta ter natančnost Cas9 proteina.

Endonukleaze sistema CRISPR, ki jih vodijo RNA molekule (RGEN)

RGEN-i (angl.: CRISPR RNA-guided endonucleases (RGENs)) so se v zadnjem času izkazale za učinkovito in skoraj da nujno platformo pri urejanju genoma. Leta 2013 so ameriški raziskovalci okarakterizirali delovanje Cas9 endonukleaz, ki so se zgodila na nepravih mestih. Dokazali so, da sistem različno tolerira enojna in dvojna neujemanja nekomplementarnih baz, glede na njihov položaj vzdolž vodilne RNA (angl.: guide RNA).

Endonukleaza Cas9 je vodena s prvimi dvajsetimi nukleotidi enoverižne vodilne RNA (sgRNA) (dolžina ~ 100 nt), da lahko inducira mestno specifičen prelom dvojne verige. Poleg tega mora biti prisoten tudi PAM motiv (angl.: protospacer adjacent motif), ki mora vsebovati zaporedje NGG ali NAG. Encim se zaradi nespecifičnosti (tolerira lahko eno- do dvojno neujemanje baz) lahko veže na podobno zaporedje na drugem delu DNA, posledično Cas9 reže na napačnem mestu. Študije so usmerjene v to, da bi Cas9 cepil bolj natančno, in sicer z dizajniranjem boljše, bolj specifične gRNA, ki bi se popolnoma prilegala tarčnemu DNA zaporedju. Lahko pa bi tudi kreirali encim, ki bi rezal le eno verigo DNA (in ne dvojne, kot navaden Cas9). Tako bi morali uporabiti dva encima sistema CRISPR ter dve gRNA. S tem bi zmanjšali možnost napak.

Do sedaj je bilo znano, da je sistem endonukleaz Cas1–3 učinkovit pri urejanju genoma bakterij, kvasovk in človeških celic, kot tudi in vivo v celotnem organizmu, kot so muhe, cebrice (vrsta rib) in miši.

Specifičnost RGEN v človeških celicah

Da bi identificirali specifičnost endonukleaz v človeških celicah, so raziskovalci izvedi test v večjem obsegu, kjer so sistematično uporabljali različne položaje nekomplementarnih baz vzdolž gRNA. Uporabili so metodo kvantitativne analize motenj zelenega fluorescenčnega proteina na osnovi človeške celice (EGFP) (angl.: quantitative human cell based enhanced green fluorescent protein disruption assay). Slednja omogoča hitro kvantifikacijo aktivnosti tarčne endonukleaze. V tej raziskavi je bila aktivnost encima kvantificirana preko pojemanja fluorescenčnega signala v človeških celicah U2OS.EGFP. Izguba signala se je zgodila zaradi premika bralnega okvirja, ki je bila posledica mutacije insercija/delecija (v nadaljevanju: indel) zaradi nehomolognega rekombinantnega zlepljanja koncev. Sintetična gRNA je usmerjala endonukleazo k različnim delom gena fluorescenčnega proteina (EGFP) (angl.: enhanced green fluorescent protein).

V nadaljnjih eksperimentih so testirali vpliv neujemanja na enem od devetnajstih nukleotidov (od skupno dvajsetih) v tarčni regiji treh sgRNA, ki so usmerjale endonukleazo na zaporedje EGFP. Niso generirali varianto sgRNA s substitucijo na mestu 20, ker je ta nukleotid del U6 promotorske sekvence. Tu mora torej ostati gvanin, da se izognemo napaki v ekspresiji. Neujemanje nukleotidov na 5' koncu gRNA je bilo lažje tolerirano, kot na 3' koncu. Za testiranje več kot enega neujemanja baznih parov med sgRNA in tarčnim DNA zaporedjem, so naredili serije variant z dvojno transverzijo (sosednji in oddaljeni položaj baz). Pokazala se je večja občutljivost za dvojne alteracije, neujemanja pa so se največkrat pojavila na 3' koncu tarčne regije. Ob prisotnosti treh ali več neujemanj baznih parov, pride do značilne izgube RGEN aktivnosti.

Mutageneza na določenih človeških genih

Naslednje vprašanje, ki so ga želeli preiskati je bilo, ali lahko identificiramo mutacije na nepravih mestih na določenih človeških genih. Uporabili so 6 sgRNA, ki so ciljala

  • tri različna mesta v VEGFA genu,
  • enega v EMX1 genu,
  • enega v RNF2 genu in
  • enega v FANCF genu.

Te sgRNA so usmerjale mutacije indel na ustreznem endogenem mestu v človeških U2OS.EGFP celicah. Za vsako od teh šestih RGEN so preverili ducat potencialnih nepravih mest, da bi dokazali mutacijo indel, ki bi jo povzročila nukleaza. Lokus je vseboval 1) genomska mesta, ki so se med seboj razlikovala v enem ali dveh nukleotidov kot tudi 2) genomska mesta, ki so se razlikovala za tri do šest nukleotidov.

Identificirali so 4 mutageneze na nepravem mestu (od 53 preverjenih) za VEGFA gen na mestu 1, 12 (od 46) na mestu 2, 7 (od 64) na mestu 3; in 1 (od 46) za EMXI. Pri genih RNF2 in FANCF niso zaznali mutacij na nepravih mestih oziroma niso zaznali napačnega delovanja endonukleaz (preverili so 43 in 50 potencialnih mest za mutacije). Stopnja mutacij na preverjenih mestih je bila zelo visoka. Ta mesta so vključevala sekvence z neujemanjem baz na 3' koncu. DNA sekvenciranje zaporedja je zagotovilo dodatno potrditev, da se indel mutacije res zgodijo zaradi nenatančnega delovanja RGEN.

Želeli so dokazati ali te nukleaze nenatančno delujejo tudi pri drugih tipih človeških celic. Te celice so namreč izbrali zato, ker so bile predhodno že uporabljene pri metodi za oceno aktivnosti TALENov, vendar pa so bile človeške celice HEK293 in K562 bolj široko uporabljene za testiranje aktivnosti nukleaz. Postopek identifikacije mutacij na nepravih mestih so ponovili na genih VEGFA (mesto 1, 3 in 3) in na EMX1 (mesto 1) še v teh dveh celičnih linijah. Vsaka od teh štirih RGEN je uspešno inducirala nehomologno zlepljanje koncev (indel mutacije) na pričakovanem mestu v obeh celičnih linijah, vendar pa z nižjo frekvenco, kot pri celični liniji U2OS.EGFP. Ne ve se zagotovo, zakaj se niso vse mutacije, ki so se pojavile pri celični liniji U2OS.EGFP, zgodile tudi v teh dveh celičnih linijah, je pa pri njima dokazana nižja aktivnost endonukleaz.

Sklep

Metoda kvantitativne analize motenj zelenega fluorescenčnega proteina je pokazala, da imajo enojna in dvojna neujemanja baz različne vplive na aktivnost RGEN, ki niso nujno vedno odvisni od njihovega položaja vzdolž tarčnega mesta. Glede na predhodne raziskave kaže, da so alteracije bolj pogoste na 3' koncu sgRNA in imajo večji efekt kot tiste na 5'; enojne in dvojne mutacije na 3' koncu se včasih vseeno dobro tolerirajo, medtem ko dvojne mutacije na 5' koncu občutno zmanjšajo aktivnost encima. Hkrati je neujemanje nukleotidov na 5' koncu gRNA lažje tolerirano, kot na 3' koncu.

Zaporedje nukleotidov gRNA vpliva na stopnjo mutageneze na nepravem mestu. Visoka vrednost CG stabilizira RNA/DNA hibride in so torej ti bolj stabilni. Posledično je toleranca do neujemanja baz višja.

Potencialna generalna strategija za znižanje mutageneze na nepravem mestu je tudi, da bi lahko se znižala koncentracija gRNA in Cas9 nukleaze. To so sicer preizkusili, a se je znižala stopnja mutacij na pravem mestu, ni pa značilno spremenila stopnjo na nepravem mestu. Rezultati so kasneje pokazali, da stopnja mutageneze ni povzročena zaradi prevelike ekspresije sgRNA ali Cas9.

Ne smemo zanemariti tudi postopka konstruiranja vektorja in izražanja sgRNA. To so izrazili s pomočjo vektorja, ki je imel na 5'-GG dinukleotid (zaradi zaporedja T7 promotorja, ki je bil uporabljen za in vitro transkripcijo). sgRNA s 5'-GG štrlečimi konci, ki je imela 18 do 20 nukleotidov komplementarnega zaporedja DNA matrici, lahko še vedno predstavlja učinkovito tarčno mesto cepitve (v večini primerov). Še vedno ni popolnoma jasno, zakaj nekatere sintetizirane sgRNA ne uspejo inducirati indel na genomskih tarčah. Ena možnost je v tem, da določena sgRNA zaporedja tvorijo sekundarne strukture, ki se potem ne morejo vezati na Cas9 ali bazni par z DNA tarčo.

Viri

Personal tools