Vloga plazmidov pri kvarjenju piva, ki ga povzročajo mlečne bakterije

Uvod

Pivo zaradi prisotnosti etanola, grenke hmeljne kisline, raztopljenega ogljikovega dioksida, zmanjšane koncentracije kisika in nizkega pH, predstavlja mikrobiološko stabilno pijačo. Zaradi svojih specifičnih karakteristik je primerno mikrookolje le za malo mikroorganizmov. Na njegovo pokvarljivost najbolj vplivata seva Lactobacillus in Pediococcus, saj sta tolerantni na hmelj, pritisk v prostoru ter nanju ne vpliva pomanjkanje hranil. Kisline v hmelju učinkujejo protibakterijsko na dva načina. Delujejo kot protonski translokatorji in razpršijo transmembranski pH gradient ter s tem zavirajo vnos hranil, kar vodi v celično stradanje. Drugi način protibakterijskega delovanja je transmembranska redoks reakcija, ki poteče ob prisotnosti Mn2+ in povzroči nastanek reaktivnih kisikovih zvrsti, ki so za celico škodljive. Toleranca mlečno kislinskih bakterij na hmelj je kompleksen večdelni sistem. Prejšnje študije so identificirale tri gene, ki delujejo kot posredniki odpornosti mlečno kislinskih bakterij na hmelj. HorA, horC in hitA. HorA zapisuje za protein, ki deluje kot ABC transporter in odstranjuje hmeljno kislino iz celice. HorC kodira za protein, ki deluje kot transporter zdravil, je odvisen od protonske gibalne sile ter prav tako odstranjuje hmeljno kislino iz celice. HitA pa naj bi deloval kot prenašalec Mn2+ iona in vzdrževatelj njegove homeostaze znotraj celice, kar vodi do zmanjšanja oksidativnega stresa. Vsi trije geni so bili določeni na plazmidih. S filogenetskega vidika vrste mlečno kislinskih bakterij, ki povzročajo kvarjenje piva niso tesno povezane. Na podlagi razdrobljene poravnave vseh zaporedij celotne plazmidne DNA, ki izhajajo iz danega seva, je bilo ugotovljeno, da je potencial kvarjenja piva bolj povezan s sestavo plazmidov in viri izolacije kot z vrsto. Z različnimi analizami je bila potrjena velika vloga najrazličnejših plazmidov za kvarjenje piva pri mlečnokislinskih bakterijah. Predpostavili so, da se različne funkcije (aktivnosti črpalke hmeljne kisline iz celice, znotrajcelično homeostazo Mn2+, modifikacijo celične ovojnice, proizvodnjo zunajceličnih polisaharidov, odziv na oksidativni stres in homeostaza pH) delijo med vrstami kot del mobilnih enot DNA, kot so plazmidi in skupaj dajejo mlečno kislinskim bakterijam zmožnost kvarjenja piva.

Geni kodirani na plazmidih uporabljeni kot diagnostični markerski geni (DMGs)

horA

Sprva so verjeli, da se zapisi za gene za toleranco proti antimikrobnemu delovanju hmeljnih kislin nahajajo na kromosomski DNA. Prvi plazmid, ki je to teorijo postavil pod vprašaj je bil pRH45, saj so pri bakteriji L. Brevis opazili padec tolerance do hmeljnih kislin v odsotnosti tega gena, ponovni vnos plazmida v celice pa je bakterijam omogočil ponovno preživetje in razmnoževanje. pRH45 nosi zapis za skupek genov (ang: gene cluster) horA in 5 odprtih bralnih okvirjev (ORFs). horA je ohranjen v mnogih sevih mlečnoskislinskih bakterij, ki so odgovorne za kvarjenje piva in nosi zapis za protein, ki je pokazal 53% ujemanje s LmrA proteinom družine ABC. Ta prenaša snovi, ki so za celico škodljive v zunajcelični prostor. Njegova prisotnost in ohranjenost v različnih sevih mlečnokislinskih bakterij kaže na to, da je prišlo do horizontalnega prenosa gena med mikroorganizmi. Pri organizmu L. Brevis eden izmed odprtih bralnih okvirjev, ORFB12, nosi zapis za encim transpozazo, za katero znanstvenik verjamejo, da je odgovorna pri transpoziciji s »cut and paste« mehanizmom. Zaradi prisotnosti horA v večini sevov mlečnoskislinskih bakterij, ki so odgovorne za kvarjenje piva so sumili, da gen lahko uporabijo kot diagnostični markerski gen (DMG). Dodatne raziskave pa so pokazale, da je prišlo do velikega števia lažno pozitivnih rezultatov; tudi sevi, ki niso odgovorni za kvarjenje piva so vsebovali gen. Znanstveniki so na koncu porišli do zaključka, da je horA odgovoren za toleranco na razne stresne faktorje in je torej le-ta neprimeren DMG.

horC

Gen horC so najprej identificirali v plazmidu s 23,4 kb pari iz organizma L. Brevis, ko so del plazmida z genom izločili iz celic in opazili padec v toleranci bakterije proti hmeljnim kislinam. HorC, produkt horC je PMF-odvisen protein, ki je prav tako, kakor HorA odgovoren za transport hmeljne kisline iz celice. V bližini horC je bil vedno prisoten tudi gen horB, za katerega raziskavekažejo, da deluje kot transkripcijski represor horC v mediju brez hmeljnih kislin. Skupek genov je poleg horB/horC vseboval 11 ORF, ki kodirajo razne encime, med katerimi so pomembni encimi za modifikacijo in odebelitev celične stene. Pri genu horC je bilo število lažno pozitivnih rezultatov pri uporabi gena kot DMG znatno nižje kot pri horA. Iz raziskav pa je bilo razvidno, da celice, ki so nosile zapis samo za ta gen niso uspešno tolerirale neugodnega okolja. Za uspešno preživetje celica potrebuje tudi gen za biosintezo maščobnih kislin (FAS), ki v sodelovanju s horC uspešno varuje celico pred hmeljnimi kislinami.

hitA

Gen hitA nosi zapis za protein iz družine Nramp (ang: natural resistance-associated macrophage family), ki je odgovoren za prenos dvovalentnih kovinskih kationov v raznih prokariontskih in evkariontskih organizmih. Ob prisotnosti hmeljnih kislin se tvori kompleks z dvovalentnimi Mn2+ ioni. Protein regulira prenos dvovalentnih ionov in skrbi za normalni potek celičnih aktivnosti, ki so od le-teh odvisne, kot npr. minimizacija oksidativnega stresa. V primerjavi z genoma horA in horC je gen hitA pokazal manjšo učinkovitost pri uporabi kot DMG.

Prisotnost horA, horC in hitA je kljub prisotnosti v večini mlečnokislinskih bakterij, ki so odgovorne za kvarjenje piva, velikokrat nekonsistentna in ni vedno primerna za uporabo kot DMG. Zaradi tega znanstveniki iščejo nove plazmidne gene, ki bi bili za to primernejši.

Eden izmed teh je gtf D15 , ki nosi zapis za putativno glikotransferazo, ki sodeluje pri glikozilaciji celične stene in drugi produkt GTF D15 , ki se veže na celično ovojnico in zaščiti celico pred hmelnjimi kislinami. gtf D15 so večkrat identificirali v horA, kar je prvič pokazalo, da se lahko več genov za varovanje celice pred delovanjem hmeljnih kislin lahko nahaja v istem skupku genov. Raziskave so pokazale, da gtf D15 deluje pri višjih temperaturah (30 °C) medtem, ko je horA najbolj aktiven pri nižjih temperaturah (15°C).