Širjenje genetskega koda

From Wiki FKKT

(Difference between revisions)
Jump to: navigation, search
Line 29: Line 29:
== Translacijski sistem ==
== Translacijski sistem ==
-
Za delujoč translacijski sistem, ki bo na rastoč peptid lahko na podlagi nenaravnih baz v kodonih dodajal tudi nekanonične aminokisline, je potrebno uspešno prepoznavanje med novimi kodoni in tRNA ter vezava nekanoničnih AK na tRNA preko prilagojenih encimov aminoacil-tRNA sintetaz (aaRS). Pari tRNA/aaRS morajo biti zelo specifični (kar velja še posebno, če bomo v prihodnosti želeli delujoč translacijski sistem z veliko hkratnimi nekanoničnimi AK). iGEM ekipa je ustvarila veliko knjižnico različnih parov tRNA/aaRS tirozil- in pirolizil-tRNA sintetaz (102.478 različnih variant) in skozi proces ciklov pozitivne in negativen selekcije prišla do sintetaz, ki so neželene nekanonične AK uspešno vezale na tRNA, ki je specifična za jantarni stop kodon UAG. Ob dodatni represiji stop funkcije zaporedja UAG, lahko dosežemo vgradnjo nekanonične AK na peptid. Efektivno UAG kodon postane kodirajoč.
+
Za delujoč translacijski sistem, ki bo na rastoč peptid lahko na podlagi nenaravnih baz v kodonih dodajal tudi nekanonične aminokisline, je potrebno uspešno prepoznavanje med novimi kodoni in tRNA ter vezava nekanoničnih AK na tRNA preko prilagojenih encimov aminoacil-tRNA sintetaz (aaRS). Pari tRNA/aaRS morajo biti zelo specifični (kar velja še posebno, če bomo v prihodnosti želeli delujoč translacijski sistem z veliko hkratnimi nekanoničnimi AK). iGEM ekipa je ustvarila veliko knjižnico različnih parov tirozil- in pirolizil-tRNA sintetaz in skozi proces ciklov pozitivne in negativne selekcije prišla do sintetaz, ki so želene nekanonične AK uspešno vezale na tRNA, ki je specifična za jantarni stop kodon UAG. Ob dodatni represiji stop funkcije zaporedja UAG, lahko dosežemo vgradnjo nekanonične AK na peptid. Efektivno UAG kodon postane kodirajoč.
Vgradnja nekanoničnih aminokislin preko jantarnega stop kodona ali manj uporabljenega levcinskega kodona (CTA) ima omejitev vgradnje le dveh AK. Pokazali so tudi, da vgradnja preko teh kodonov zavre rast bakterijskih celic. Zaradi teh omejitev in stranskih učinkov, bo treba v prihodnosti razviti delujoč sistem v katerem se bodo nekanonične aminokisline vgrajevale preko kodonov, ki bodo vsebovali tudi nenaravne dušikove baze.
Vgradnja nekanoničnih aminokislin preko jantarnega stop kodona ali manj uporabljenega levcinskega kodona (CTA) ima omejitev vgradnje le dveh AK. Pokazali so tudi, da vgradnja preko teh kodonov zavre rast bakterijskih celic. Zaradi teh omejitev in stranskih učinkov, bo treba v prihodnosti razviti delujoč sistem v katerem se bodo nekanonične aminokisline vgrajevale preko kodonov, ki bodo vsebovali tudi nenaravne dušikove baze.

Revision as of 07:49, 15 January 2018

Projekt ekipe Bielefeld-CeBiTec 2017

iGEM wiki: http://2017.igem.org/Team:Bielefeld-CeBiTec

Povzel Matic Kovačič

Namen iGEM ekipe Bielefeld-CeBiTec 2017 je bil vnos plazmida z dvema nenaravnima komplementarnima nukleotidoma v bakterijo E. coli in ohraniti njuno prisotnost v genomu skozi rast in razmnoževanje bakterije. Z uporabo novih ortogonalnih parov tRNA/aminoacil-tRNA sintetaza pa so preko jantarnega stop kodona (UAG) in redko uporabljenega levcinskega kodona (CUA) tudi uspeli izražati proteine z vgrajenimi nekanoničnimi aminokislinami. Njihove raziskave so zelo pomembne za prihodnost sintezne biologije, čeprav pri svojem delu dodatnih nukleotidov v genomu niso neposredno povezali s povečanjem števila kodonov preko katerih bi se proteini z novimi nekanoničnimi aminokislinami funkcionalno izražali.

Genomi vseh živih bitij so zgrajeni iz štirih različnih nukleotidov, ki lahko tvorijo 64 različnih tromestnih kodonov. Kodoni določajo katera tRNA z vezano aminokislino se bo s svojim komplementarnim antikodonom vezala na mRNA v procesu translacije in oddala eno od dvajsetih kanoničnih aminokislin na nastajajoč peptid. Poleg kanoničnih aminokislin obstaja še več sto nekanoničnih aminokislin, od katerih ima vsaka edinstvene lastnosti. Za uspešno vgrajevanje teh aminokislin bi morali spremeniti namembnost nekaterih kodonov, da bi se na njih vezale tRNA z nekanoničnimi aminokislinami. Lahko pa bi tudi povečali število vseh možnih kodonov z vključitvijo nenaravnih nukleotidov v genom. En dodaten nukleotid, bi število možnih kodonov dvignil s 64 na 125, dva dodatna nukleotida, ki bi tvorila tudi nenaraven bazni par, pa bi število možnih kodonov dvignila na kar 216.

Contents

Nenaravni bazni pari

Obstaja veliko različnih nenaravnih nukleotidov, ki se lahko med seboj povezujejo v bazne pare. Povezave so lahko posledica vodikovih vezi, hidrofobnih interakcij, od kovinskih ionov odvisnih interakcij in energijsko ugodnega nalaganja aromatskih obročev. Ekipa Bielefeld-CeBiTec se je odločila uporabiti komplementarna nukleotida izogvanin (isoG), ki je strukturni izomer gvanina, ter 5-metil-izotimin (isoTm), ki je metiliran strukturni izomer timina. Za ta izomera je značilno, da imata aminske, imino in keto skupine na drugih položajih benzenskega obroča. Podobnost z naravnim gvaninom in citozinom je povečala možnost uspešne replikacije plazmidov v E. coli s Taq DNA polimerazo. Nenaravni bazni isoG-isoTm par so raziskovalci vnesli samo v en plazmid in z njim transformirali BL21 E. coli bakterije.

Sprejem nenaravnih nukleotidov v celice in preučitev njihove biosinteze

Ključnega pomena pri razvoju sintetskih organizmov je njihova zmožnost absorpcije ali sinteze različnih prekurzorskih molekul. Raziskovalci iGEM ekipe so morali bakterijam E. coli omogočiti absorpcijo deoksinukleozid trifosfatov nenaravnih DNA baz iso-CmTP in iso-GTP. E. coli nima zapisa za celične transporterje trifosfatov. Razzlog naj bi bila odsotnost ATP v ekstracelularnem prostoru in možnost uhajanja ATP iz notranjosti celic. Celice E. coli BL21(DE3) so transformirali s plazmidom pCB1C3, ki je vseboval zapis za trifosfatni receptor PtNTT2 iz alge Phaeodactylum tricornutum. Pred zapis za transportni protein so vstavili še lacUV5 promotor in močan zapis za RBS. Za cds regijo proteina so vstavili še zapis za GFP. PtNTT2 so izbrali, ker ni specifičen za obliko nukleozid trifostatov in lahko trifosfate transportira tudi čez plastidno membrano brez porabe energije. Uspešen transport nukleozid trifosfatov so dokazali s prisotnostjo ATP v gojišču, saj se za vsak vnešen nenaraven nukleozid trifosfat preko PtNTT2 iz celice prenese nek drug oz. enak nukleozid fosfat (counter exchange mehanizem). Preučili so tudi biosintezo izogvanozina v rastlini Croton TIglium, v kateri je večina sekundarnih metabolitov toksična (zaščita pred herbivori in patogeni). Po preučitvi klasične purinske sintezne poti so prišli do zaključka, da v Croton Tiglium izogvanozin obstaja kot intermediat v tej sintezni poti.

Zadrževalni/ohranitveni sistem nenaravnih baznih parov

Za ohranitev vgrajenih nenaravnih nukleotidov v bakterijskemu genomu je potreben mehanizem, ki bo uničil bakterijske celice, če pride do mutacij, ki bi nenaravni bazni par isoG-isoTm odstranile. Do odstranitve lahko pride preko petih različnih točkovnih mutacij, in sicer preko mutacije v 4 druge naravne bazne pare ali pa preko delecije nenaravnega baznega para. To ohranitev so dosegli s prilagojenim sistemom CRISPR/Cas9, ki je bil sposoben zaznave teh mutacij na zaporedju z isoG-isoTm in nato cepitve plazmidov, ki so nenaravni bazni par izgubile. Bakterije so transformirali z dvema plazmidoma. Prvi plazmid pSB1K3 , ki se nahaja v bakteriji v veliko kopijah vsebuje zapis za nukleozid trifosfatni transporter PtNTT2 in protein cas9, ki razgrajuje drugi plazmid z izgubljenim isoG-isoTm baznim parom. Drugi plazmid pSB3C5 (v celicah se nahaja v majhnem številu kopij) vsebuje nenaravni bazni par in pet različnih sgRNA (single guide RNA), ki se komplementarno vežejo na zaporedje, ki je izgubilo isoG-isoTm bazni par in omogočijo cepitev takega zaporedja s Cas9. Vsak plazmid je vseboval drugačen selekcijski marker (rezistenco proti antibiotikom).

Ovire pri delu z nenaravnimi baznimi pari

Večina laboratorijskih protokolov se nanaša na štiri-črkovno DNA. Zato je treba pri delu z nenaravnimi baznimi pari prilagoditi večino postopkov kot so PCR, kloniranje in sekvenciranje DNA. Prav tako večina bioinformatskih orodij (npr. BLAST) ne deluje z dodatnimi baznimi pari ali razširjenim repertoarjem aminokislin. Tudi večina celičnih komponent je prilagojena A, T, G, C DNA. Nenaravne bazne pare celica zazna kot tuje in poskuša popraviti DNA s temi modifikacijami. Upoštevati je treba tudi termično stabilnost novih baznih parov. Tudi vsi proteini, ki sodelujejo pri transkripciji in translaciji morajo biti prilagojeni. Za sekvenciranje modificirane DNA je iGEM ekipa uporabila Oxford Nanopore Sequencing, saj ne vsebuje dodatnih spojin specifičnih za bazne pare. Ta tehnologija bo v prihodnosti ključna pri sekvenciranju sintetske DNA z različnimi modifikacijami. Razvili so tudi metodo M. A. X. (Mutational Analysis Xplorer, ki temelji na komplementarnih zaporedjih specifičnih za različne točkovne mutacije nenaravnega baznega para (oligi vsebujejo restrikcijska mesta), in razgradnji teh oligonukleotidov z restriktazami.

Translacijski sistem

Za delujoč translacijski sistem, ki bo na rastoč peptid lahko na podlagi nenaravnih baz v kodonih dodajal tudi nekanonične aminokisline, je potrebno uspešno prepoznavanje med novimi kodoni in tRNA ter vezava nekanoničnih AK na tRNA preko prilagojenih encimov aminoacil-tRNA sintetaz (aaRS). Pari tRNA/aaRS morajo biti zelo specifični (kar velja še posebno, če bomo v prihodnosti želeli delujoč translacijski sistem z veliko hkratnimi nekanoničnimi AK). iGEM ekipa je ustvarila veliko knjižnico različnih parov tirozil- in pirolizil-tRNA sintetaz in skozi proces ciklov pozitivne in negativne selekcije prišla do sintetaz, ki so želene nekanonične AK uspešno vezale na tRNA, ki je specifična za jantarni stop kodon UAG. Ob dodatni represiji stop funkcije zaporedja UAG, lahko dosežemo vgradnjo nekanonične AK na peptid. Efektivno UAG kodon postane kodirajoč. Vgradnja nekanoničnih aminokislin preko jantarnega stop kodona ali manj uporabljenega levcinskega kodona (CTA) ima omejitev vgradnje le dveh AK. Pokazali so tudi, da vgradnja preko teh kodonov zavre rast bakterijskih celic. Zaradi teh omejitev in stranskih učinkov, bo treba v prihodnosti razviti delujoč sistem v katerem se bodo nekanonične aminokisline vgrajevale preko kodonov, ki bodo vsebovali tudi nenaravne dušikove baze.

Vgradnja nekanoničnih aminokislin za različno uporabo

Raziskovalci so ustvarili osem različnih parov tRNA/aminoacil-tRNA sintetaz od katerih je bila vsaka zmožna vezave določene nekanonične aminokisline na tRNA jantarnega UAG stop kodona. Te aminoacil-tRNA sintetaze so tudi vnesli v register biokock. Teh osem aminokislin ima različne lastnosti, ki bodo zagotovo zelo uporabne pri nadaljnih raziskavah. Glede na uporabo so te aminokisline razdelili v pet različnih skupin, in sicer v skupino strukturnega analiziranja, fotostikal, označevanja, fotolize in povezovanja. Za strukturno analizo lokacije nekanoničnih AK so uporabili aminokislini, ki sta bili označeni s fluoroforjem in sta sposobni Foersterjevega resonančnega energijskega prenosa. To poenostavljeno pomeni, da lahko ena aminokislina absorbira foton določene valovne dolžine, to energijo prenese na drugo AK, ta pa emitira svetlobo drugačne valovne dolžine. Za to morata biti AK dovolj skupaj, torej bi se metoda lahko uporabila za strukturno analizo pozicij nekanoničnih aminokislin v proteinu. Za name fotostikal se lahko uporabi aminokislino, ki ob obsevanju s svetlobo določene valovne dolžine, spremeni svojo konformacijo, kar lahko inhibira delovanje proteina. Za namen označevanja, bi lahko v protein vgrajevali nekanonične AK, ki imajo vezano fluorescenčno skupino. Nekanonične aminokisline sposobne fotolize so alternativa mestno specifični cepitvi peptidne vezi s strani celotni encimov. Fotolitične aminokisline inducirajo cepitev peptidne vezi, če absorbirajo svetlobo določene valovne dolžine. Za alternativno kovalentno povezovanje dveh aminokislin (podobno povezavi cisteinov) ali aminokisline na neko površino se lahko uporabi aminokisline z različnimi stranskimi skupinami. iGEM ekipa je povezala aminokislini, ki sta vsebovali 1,2-aminotiolno skupino in cianobenzotiazolno skupino ter na tak način tudi povečala stabilnost SELP (Silk Elastin like Proteins) polimera.

Personal tools