View source for APIS- nov pristop za zdravljenje okužbe z Nosema caranae pri čebelah

povezava do projekta: http://2018.igem.org/Team:UAlberta

==UVOD==

APIS oz. Antifungal Porphyrin based Intervention system je projekt, ki so ga na letošnjem iGEM predstavili študentje iz univerze v Alberti. Njihov cilj je bil ustvariti nov izboljšan sistem v boju proti okužbam čebel z parazitom Nosema ceranae [1].

==NOSEMA CARANAE IN NJENO DOSEDANJE ZDRAVLJENJE==

Nosema Caranae  je okužba z glivnim parazitom iz skupine Microsporidia in je ena najbolj pogostih in razširjenih okužb čebel. Ko čebele zaužijejo spore, te potujejo v srednje črevo in se naselijo v epitelijske celice. V posamezni celici se gliva razmnožuje in tvori nove spore. Le te lahko okužijo sosednje celice v črevesju čebele ali pa se izločijo in omogočajo širjenje okužbe na druge čebele [2]. Diagnosticiranje je zelo težko, zagotovo lahko okužbo potrdimo samo s pregledom v laboratoriju [5]. 

Zdravil za zdravljenje okužbe na tržišču ni veliko, trenutno se pravzaprav uporablja samo fumagilin. To je naravni antibiotik, ki so ga izolirali iz glive Aspergilus fumigates. Samo spojino, ki je v komercialne namene dostopna v obliki dicikloheksil aminske soli, se uporablja v terapevtske namene pri mnogih organizmih (npr. zavira angiogenezo zato se uporablja za zdravljenje raka). Deluje kot inhibitor ecima metionin aminopeptidaza tipa II in sicer tako, da se preko interakcije z histidinom veže v aktivno mesto. Encim je zelo pomemben za zorenje in postranslacijske modifikacije proteinov zato je njegova inhibicija za organizem lahko smrtna. Kot terapevtik je fumagilin dokaj učinkovit vendar se ga zaradi dokazane genotoksičnosti uporablja vedno manj (tudi dicikloheksil amin je dokazano toksičen)[3].

==PROJEKT APIS==

Prav zaradi toksičnosti fumagilina in potreb po novih oblikah zdravljenja okužbe Nosema so se študentje odločili razviti svoj sistem APIS.
Iz literature so pridobili podatke o učinkovitosti porfirinov. In vivo so tem molekulam že dokazali učinkovitost proti raznim bakterijam, virusom in glivam. V članku pa so se osredotočili prav na učinek porfirinov (natančneje protoporfirin amida PP(Asp)2 ) na parazite iz družine Nosema. Čebele so 14 dni hranili z raztopino PP(Asp)2 v sukroznem sirupu in spremljali učinek na čebele in same spore. Ugotovili so, da se je število spor po dveh tednih zmanjšalo za približno 56%, preostale spore pa so bile v veliko slabšem stanju kot pred tretmajem [4].

Postavili so si dva cilja:
1.	Vzpostaviti sistem za prekomerno izražanje PPIX v E.coli

2.	Preveriti oziroma dokazati pozitiven učinek PPIX na čebele okužene z Nosemo caranae.

Kot izbrani porfirin so testirali PPIX (protoporfirin IX), ker je ta že naravno prisoten v E.coli. PPIX je zadnji intermediat v biosintezni poti hema pri E.coli.  Gene, ki kodirajo za encime prisotne v tej poti so vključili v plazmid in z njim transformirali E.coli (geni HemA do HemH). Transformacija jim je uspela vendar so pri opazili zelo različen nivo izražanja encimov in se strinjajo, da bi bilo sistem potrebno še nekoliko optimizirati.

===REZULTATI===

===='''Ali so visoke koncntracije PPIX toksične za E.coli?'''====
Bakterije so čez noč gojili v mediju z različnimi koncnetracijami PPIX (najvišja uporabljena je bila 240 µM. PPIX je paricipitral iz raztopine v obliki rdečih granul kar jim je onemogočilo natančno merjenje. Ob podaljšnju gojenja je raztopina postajala vedno bolj motna zato so zaključili, da so celice ostale žive in se sinteza PPIX nadaljuje. Dokazali so, da visoke koncentracije PPIX niso toksične za E.coli in le to lahko uporabijo kot šasijo.

===='''Karakterizacija PPIX'''====
Pri tem poskusu so v plazmid vključili samo gen HemA, ki kodira za encim 5-aminolevulinat sintazo in tako katalizira prvi korak v sintezi hema. PPIX, ki se je izločil v medij so izolirali v dveh različnih topilih in analizirali z merjenjem fluorescence in TLC. V obeh primerih so rezultate primerjali z kupljeno raztopino PPIX.
Pri fluorescenci so opazili, da se vrhovi ne pojavljajo pri 635nm kot je zapisano v literaturi. V svojih analizah so dobili dva tipična vrha pri 608 in 666nm. Kasneje so ugotovili, da vrh pri 635nm velja za PPIX v vodni raztopini sami pa so uporabljali organsko topilo. Ker sta se dobljena grafa za obe uporabljeni topili med seboj ujemala so zaključili, da lahko razlike pripišemo topilu in je testirana snov res PPIX.
TLC je njihove rezultate še potrdil. Tudi tukaj so testirali založno raztopino kupljenega PPIX v obeh topilih in PPIX izoliran iz medija. Dobljeni Rf so se med seboj minimalno razlikovali, razlog so zopet pripisali razliki v topilu. Tako so preverili, da se ne izraža noben drug intermediat v sintezni poti saj bi imel povsem drugačen Rf kot kupljena založna raztopina. V obeh topilih so opazili dve zvrsti. Ena je potovala s topilom, druga pa je ostala povsem na začetku kar pomeni, da je močno reagirala z polarno stacionarno fazo. Zvrsti so identificirali kot protoniran in deprotoniran PPIX (na začetku je ostal deprotoniran PPIX).

===='''Eskperiment in vitro'''====
S tem poskusom so potrdili, da lahko sintetiziramo PPIX samo z encimi prisotnimi na plazmidu brez pomoči tistih, ki se že nahajajo v celici. Pripravili so raztopino vseh encimov in aminolevulinske kisline (ALA) s katero se sinteza hema začne. Raztopino so čez noč stresali pri 37°C, naslednji dan pa so enako kot prej izmerili fluorescenco. Dobljeni graf se je skoraj popolnoma ujemal z dobljenimi pri karakterizaciji PPIX. Opazili so le majhen dodaten vrh pri 626 nm, ki pa je najverjetneje predstavljal del ALA, ki ni zgreagiral.

===='''Ali je E.coli toksična za čebele?'''====
V drugem delu poskusov so študentje želeli dokazati pozitiven učinek PPIX na čebele okužene z Nosema Caranae. Ker so želeli kot sistem uporabiti bakterije E.coli so morali najprej testirati toksičnost teh na čebele. Različne koncentracije E.coli so v raztopini sukroze vključili v prehrano zdravih in okuženih čebel. Vsak da so prešteli in dokumentirali število mrtvih čebel ter po koncu naredili graf, ki je predstavljal procent preživelih čebel v odvisnosti od časa. Bakterija, ki se sicer ne pojavlja v črevesju čebel se ni izkazala za toksično. Statistično relevantno odstopanje so opazili samo pri eni od skupin. Ker je bila to skupina, ki je s hrano dobivala najmanjšo koncentracijo PPIX in pri višjih koncentracijah podobnega trenda niso opazili so zaključili, da gre verjetno za izjemo oz napako pri merjenju.

===='''Vpliv PPIX na preživetje čebel'''====
Končno so testirali še vpliv PPIX na čebele. Zdrave in okužene čebele so razdelili v tri skupine. Ena, kontrolna je prejemala samo saharozni sirup, druga raztopino Tris/EtOH (kontrola toksičnosti topila) in zadnja raztopino PPIX. Tudi tukaj so stalno spremljali število preživelih čebel in na koncu pripravili analizo. Topilo se je izkazalo kot povsem ne toksično za celice, pri tistih hranjenih z PPIX pa so dokazali statistično signifikantne razlike. Število spor se je zmanjšalo iz nekaj milijonov na nekaj deset tisoč). S tem poskusom so dokazali, da lahko zmanjšanje števila spor in podaljšanje življenja pripišemo samo delovanju porfirina kar pomeni, da ti predstavljalo dobrega kandidata v razvoju novih načinov zdravljenja.

==ZAKLJUČEK==
Študentje so v svojem poskusi dokazali, da bi APIS lahko uporabili za zdravljenje čebel okuženih z to parazitsko glivo. Zavedajo se, da je potrebnih še nekaj izboljšav zato bi radi poskuse nadaljevali in APIS razvili dokončno. Določiti je potrebno tudi končni način uporabe sistema. Zaenkrat sta predstavljeni dve možnosti. Transformirano E.coli v kateri se prekomerno sintetizra PPIX, bi lahko direktno vključili v prehrano čebel ali pa bi bakterije uporabili za masovno proizvodnjo PPIX in potem samo tega dodali čebelam.
Kljub temu da nosemavost spada med najbolj razširjene okužbe čebel po celem svetu za zdravljenje trenutno nimamo pravih učinkovin. Kot prikazano sistem APIS kaže obetavne rezultate in bi lahko po nekaterih izboljšavah in optimizacijah znatno izboljšal naše možnosti v boju proti tej okužbi.

'''
== VIRI ==
'''
1.      http://2018.igem.org/Team:UAlberta, citirano 14.1 2019

2.	Gisder S., Möckel, N., Linde A. in Genersch E., A cell culture model for Nosema ceranae and Nosema apis allows new insights into the life cycle of these important honey bee-pathogenic microsporidia, Environmental Microbiology (2011) 13(2), 404–413

3.	Van den Heever J., Thompson S. T., Curtis J.M.,Ibrahim A. in Pernal S.A., Fumagillin: An Overview of Recent Scientific Advances and Their Significance for Apiculture, journal of agriculutre and food science (2014),  62, 2728−2737 

4.	Ptaszyńska A.A, Trytek M., Borsuk G., Buczek K., Rybicka-Jasińska K:. in Gryko D., Porphyrins inactivate Nosema spp. Microsporidia, ScIentIFIc RePorTs (2018) ,8, 1-11

5.	http://beeaware.org.au/archive-pest/nosema/ , citirano 14.1 2019