Ali lahko naravna diverziteta quorum sensinga pripomore k napredku v sintezni biologiji?
Uvod
Quorum sensing omrežja omogočijo bakterijam, ki smo jih še nedolgo časa nazaj imeli za "molčeče individualiste", zaznavanje in odzivanje na kemijske signale, ki jih izločajo sosednje bakterijske celice. Genetsko vezje quorum sensing sistema so znanstveniki najprej odkrili pri Vibrio fischeri, raziskovanja drugih mikrobnih genomov pa so razkrila še mnogo Lux homologov, ki jih vse skupaj uvrščamo v homoserin laktonska (HSL) quorum sensing omrežja. Sem spadajo tako širše znani N-acil homoserin laktoni, kot tisti z neacilnim repom na homoserin laktonskem obroču (1). So preprostejša, bolj raznolika in zahtevajo malo modifikacij, da funkcionirajo po pričakovanjih ob prenosu v nove gostiteljske celice, v primerjavi z drugimi družinami bakterijskih komunikacijskih omrežij (1,2). Moj članek se je osredotočil na njih.
Module iz naravnih QS omrežij lahko razklopimo in vgradimo v sintetične sisteme
Sintezni biologi pogosto uporabijo HSL QS omrežja za vgraditev novih vedenj v prokariontske mikroorganizme. V takih načrtanih sistemih so ta omrežja pogosto uporabljena kot set razklopljenih komponent, kjer je HSL sintaza "pošiljatelj" (Sender), regulator in promotor pa sta "sprejemnik" (Receiver). Omenjene komponente QS omrežij lahko uporabimo kot "genetske žice", ki povežejo vstopni stimulus z ekspresijo izhodnega gena (1). Bistveno pri quorum sensingu je, da se sproži prepisovanje genov v vseh celicah hkrati, kar lahko dosežemo tudi v naših prilagojenih sistemih. Gre za učinkovito strategijo pri doseganju robustne sistemske dinamike (2).
HSL Quorum sensing omrežja so široko razširjena: najdenih je več kot 100 različnih LuxI homologov (1,4). Opisana diverziteta nakazuje na potencial, da bi lahko uporabili naravne proteinske variante za zgraditev paralelnih QS komunikacijskih poti, ki bi bile specifične vsaka za svoj vstopni signal. Prvi problem nastane, ker naletimo na nepričakovano navzkrižno komunikacijo. To so pokazali Canton in sod., ko so gen za GFP postavili pod promotor reguliran z LuxR. Štirje kemijsko različni acil-HSL in eden v višji koncentraciji, so vsi aktivirali ekspresijo GFP in to do enake stopnje ali pa še višje kot dejanski LuxI AHL, 3O-C6-HSL (5). Poleg tega pa tudi veliko različnih HSL sintaz proizvaja enak acil-HSL kot LuxI . Logično bodo te poti imele zelo visoko raven navzkrižnega pogovarjanja, če jih vgradimo v isto omrežje (npr. EsaI in ExpI iz Erwinia spp.) (1). Drugi problem je to, da čeprav je QS popularno orodje med sinteznimi biologi, so široko uporabljane in za namene sintezne biologije adaptirane le tri različne signalne poti: Lux, Las in RhI. Vsa ta omrežja med seboj navzkrižno komunicirajo, kar močno oteži konstrukcijo kompleksnih genetskih sistemov s QS omrežji (1). Do "cosstalk-a" lahko pride med QS potmi posamezne vrste (LasI/LasR in RhlI/RhlR iz Pseudomonas aeruginosa) ali med različnimi vrstami (Burkholderia cepacia in P. aeruginosa, ki sookužita paciente s cistično fibrozo). Lahko se pojavi tudi na nivoju tarče, za kar so krive podobnosti med promotorsko sekvenco in DNA-vezujočo domeno znotraj regulatornega proteina (1).
a) Razširitev seta ortogonalnih QS omrežij (1)
Maloštevilčnost edinstvenih QS sistemov in njihova nagnjenost k navzkrižni komunikaciji omejujeta uporabnost trenutnega seta QS pripomočkov. Sintezna vezja so lahko načrtana za detekcijo specifičnih kombinacij vhodnih signalov, dokler vsaka vključena pot obratuje neodvisno (ortogonalno) brez neželene navzkrižne komunikacije. Če želimo zgraditi kompleksna vezja, ki se odzivajo na signale, proizvedene s strani živih celic ali zapletene kombinacije okoljskih pogojev, so ortogonalne QS poti nujno potrebne, saj mora vezje razlikovati številne različne vhodne signale in jih nato integrirati. "Genetske žice" lahko povezujejo elemente genetskega vezja znotraj populacije enega ali večih sevov. Delitev dela preko populacije večih sevov je lahko ključna pri izvrševanju zahtevnih logičnih funkcij ("biocomputation"), saj se energijske zahteve kompleksnega "računanja", ki bi bile za eno samo celico prevelike, porazdelijo. Kompleksna vezja bi torej lahko izvedli tako, da bi povezali celice različnih sevov, ki bi izvajale različna preprosta samostojna "računanja" z ortogonalnimi QS žicami (1,2). Do danes, ravno zaradi "crosstalk-a", še ni objavljenega dela, kjer bi uporabili tri ali več ortogonalna QS omrežja v enem samem sistemu.
- pametno načrtovanje genskih mrež (gene-network engineering pristopi). Potrebno je preučiti, kako pametno zgraditi genske mreže, da bodo najbolj optimalne, kar pomeni s čim manj navzkrižne komunikacije. Brenner in sod. so ta pristop uporabili, da bi se ublažili "crosstalk-u" med Las in RhI omrežjema. Omrežji so vstavili vsako v svoj sev, da so se izognili promotor-regulator "crosstalk-u", poleg tega pa so kontrolirali ekspresijo HSL sintaze preko pozitivne povratne zanke (6).
- uporaba QS poti iz različnih družin. Znanstveniki so odkrili še druge različne družine signalnih molekul, med njimi so najpomembnejši avtoinducirajoči (oligo)peptidi (AIP) pri Gram pozitivnih bakterijah in avtoinduktor-2 (AI-2) družina. Velike razlike v kemijskih strukturah (laktonski obroči, peptidi, furanonove spojine) teh signalnih molekul nakazujejo, da navzkrižna komunikacija najverjetneje ni mogoča. Poleg tega so AIP ekstremno vrstno specifični in bi zagotavljali odlično kontrolo v sinteznih sistemih (7). Ta pristop pa je lahko omejen v svoji fleksibilnosti, saj medtem ko večina HSL mrež potrebuje le dva proteina in en promotor, pa tako AI-2 kot AIP zahtevajo aktivni transport in številne proteine za generacijo in detekcijo signala (1,4,8). To prinese s seboj večji metabolni strošek, ki ga moramo vzeti v zakup ob načrtovanju kompleksnih vezij. Dodatni vzrok za skrb je lahko počasnejša difuzija večjih oligopeptidov v primerjavi z manjšimi AHL, še posebej v trdni kulturi (7).
- uporaba usmerjene mutageneze. Z mutacijskimi analizami in 3D proteinskimi strukturami lahko identificiramo ključne aminokislinske ostanke, ki so odgovorni za interakcijo med regulatorji in acil-HSL ligandi. Tako lahko generiramo regulatorje, ki se specifično odzivajo na katerikoli željeni HSL. Ta pristop je tehnično zastrašujoč, poleg tega pa generira mutante, ki imajo le minimalno spremenjen vezavni žep glede na divji tip, kar omejuje obseg možnih novih vedenj. Poleg tega se vežejo in aktivirajo enak promotor kot divji tip (1).
- raziskovanje drugih mikrobnih genomov in iskanje QS homologov, ki jih še ne uporabljamo v sintezni biologiji. Glavna prednost pristopa je, da je naravna evolucija že odkrila funkcionalne regulatorje v zelo obsežnem prostoru aminokislinskih zaporedij. Poleg tega lahko najdemo regulatorje zelo različnih velikosti, pri umetni selekciji pa se novo nastali iz praktičnih razlogov ne razlikujejo bistveno od že obstoječih primarnih struktur (1).
Osnova specifičnosti v HSL signalni družini (1)
Osredotočili se bomo na raznolikost v geometrijah HSL signalnih molekul in HSL-vezavnih žepov znotraj regulatorjev, čeprav specifičnost določa tudi operatorsko vezavno mesto na promotorju.
Obsežna molekularna raznolikost naravno pojavljajočih se HSL molekul nakazuje na to, da obstaja mnogo različnih HSL signalov in s tem mnogo ortogonalnih poti. HSL se razlikujejo po R-skupini, acilnem ali arilnem repu, ki se, pritrjen preko amidne vezi, izteza iz homoserinlaktonske glave. HSL sintaze proizvajajo HSL z različno dolgimi (od 4 do 18 ogljikovih atomov; ponavadi sodo število) in nasičenimi ogljikovimi repi, ki imajo lahko različne stranske skupine na tretjem ogljiku: karbonilno, hidroksilno ali metilno. Arilne R-skupine imajo fenolno ali fenilno skupino na C3. Nenasičenost se odraža v dvojni C-C vezi, ki spremeni obliko acilnega repa glede na nasičeno obliko (1,8). Krajši repi od 4 ogljikovih atomov so zelo redki. Razlog je verjetno v tem, da je laktonska glava močno dovzetna na od pH-ja odvisno odprtje obroča. To se zmanjšuje z daljšanjem repa. Tako se C4-HSL popolnoma odpre šele pri pH 8, medtem ko je 70 % C3-HSL že hidroliziranega do pH 6 (4). Ena sama HSL sintaza lahko producira dva ali več HSL signala, odvisno od afininet do vezave različnih acil-prenašalnih proteinov (ACP) ali aril-koencima A, ki prinesejo različne repe (1).
Regulatorski proteini iz HSL družine imajo dve glavni domeni: N-terminalno avtoinducer-vezujočo in C-terminalno, ki veže DNA. Prva vsebuje beta ploskev iz petih trakov, ki je vstavljena med dva šopka iz po treh alfa heliksov. DNA vezujoča domena je heliks-zavoj-heliks (HTH) regija iz 4 alfa heliksov, kar je pogost DNA vezavni motiv. Analize vezavnih žepov za HSL so pokazale, da oblika, velikost, hidrofobnost in funkcionalizacija določajo vezavno afiniteto regulatorja za specifičen HSL. To pomeni, da lahko na podlagi znanih HSL-regulator interakcij identificiramo možne kandidate za ortogonalna QS omrežja. QS sistemi, ki proizvajajo acil-HSL z dolgimi, ravnimi verigami, naj bi imeli regulatorje z daljšimi vezavnimi žepi. Podobno naj bi regulatorji sistema z acil-HSL z razvejanimi funkcionalnimi skupinami imeli regulatorje z vezavnimi žepi, ki te skupine "udobno objamejo". Tako lahko sistem s HSL molekulami, ki imajo relativno kratke ogljikovodikove repe in okorne stranske skupine, sumimo za ortogonalen sistemu, ki uporablja dolgoverižne, nerazvejane HSL. Primerjava atomskih geometrij ligandov je odkrila, da so za njihovo (ne)učinkovitost odgovorne: razdalje med hidrofobnimi regijami ter regije z donorji in akceptorji vodikovih vezi znotraj R-skupine (1).
Ohranjenost in raznolikost v konformacijah HSL vezavnih regij regulatorjev podpirata idejo, da so variacije v R-skupinah HSL tiste, ki so odgovorne za selektivne regulator-ligand interakcije. Za glavno vodilo so vzeli rešeno strukturo TraR regulatorja. Vezavni žep veže eno samo HSL molekulo med pettrakovno antiparalelno beta ploskev in šopek iz treh alfa heliksov. V primarni strukturi TraR so te sekundarne strukture razporejene v vzorcu b-b-a-a-b-a-b-b. Prvi in zadnji alfa heliks ter zadnji beta trak sestavljajo aminokisline, ki tvorijo vodikove vezi z laktonsko glavo. Te ostanki so močno ohranjeni v LuxR homologih, kar kaže na skupen vezavni mehanizem za nevariabilno glavo. V nasprotju s tem se variabilni rep razteza v regijo, ki je manj ohranjena, kar potrjuje mehanizem za HSL selektivnost. Vse ni tako črno belo, najdemo regulatorje z ohranjenim vzorcem, ki se dejansko odzivajo na enake ligande, pa tudi take, ki se ne. Zanimivo pa se nobeden od HSL regulatorskih motivov ne pojavlja v GtaR. Ta kaže ohranjeno sekvenco z TatD družino deoksiribonukleaznih proteinov, ki tako kot LuxR homologi vsebujejo mešane beta trakove in alfa helikse. Glede na njegovo posebno razporeditev sekundarnih struktur, bi GtaR lahko predstavljal edinstven razred HSL regulatornih proteinov (1).
Očitno je nemogoče kar privzeti, da struktura vezavnega žepa in atomska geometrija liganda določata ortogonalnost. Za odkritje novih ortogonalnih QS poti, s katerimi bomo lahko zgradili, do sedaj nedosegljive, visoko sofisticirane biološke sisteme, so potrebne nadaljnje raziskave, ki pa so omejene s skopostjo 3D strukturnih podatkov za regulatorne proteine.
