Analiza transkriptoma Acremonium chrysogenum in Penicillium chrysogenum, dveh nesorodnih gliv, ki proizvajata β-laktame. Ključne tarče v programih izboljšave sevov so velvet-regulirani geni

From Wiki FKKT

Jump to: navigation, search

Contents

Uvod

Cefalosporini in penicilini so najpogosteje uporabljeni β-laktamski antibiotiki za zdravljenje različnih okužb pri človeku. V industriji za proizvodnjo teh antibiotikov uporabljajo predvsem dva seva gliv – A. chrysogenum in P. chrysogenum, filamentozni glivi iz debla askomicete, ki sta le šibko taksonomsko povezani. Obe glivi sta predmet intenzivnega programa izboljševanja sevov, katerih cilj je s številnimi koraki naključne mutageneze vplivati na povišanje β-laktamskih titrov v proizvodnji. Raziskovalci so v članku ugotavljali, do kakšnih genetskih prilagoditev je tekom izboljševanja sevov prišlo.

Filogenetska analiza

Na podlagi aminokislinskih zaporedij za encim izopenicilin N sintetazo (PcbC) - enega izmed ključnih encimov v sintezi β-laktamov - so pri 18 pro- in evkariontskih mikroorganizmih izrisali filogenetsko drevo. Z izrisom filogenetskega drevesa so raziskovalci prikazali (šibko) sorodnost med A. chrysogenum in P. chrysogenum. V nadaljevanju jih je zanimalo, ali je v obeh glivah tekom izboljševanja sevov prišlo do podobnih genetskih prilagoditev, zato so primerjali transkriptom divjih ter industrijskih sevov A. chrysogenum in P. chrysogenum.

Sevi

Uporabili so šest sevov, po tri različice za vsako izmed gliv. Pri P. chrysogenum so primerjali seva NRRL 1951 (divji tip) in P2niaD18 (industrijski sev), pri A. chrysogenum pa ATCC 11550 (divji tip) in A3/2 (industrijski sev). Uporabili so tudi sev z delecijo gena velvet vsake izmed gliv.

Metode

Vse seve so najprej gojili v optimalnih pogojih za merjenje aktivnosti genov, ki sodelujejo v biosintezi β-laktamskih antibiotikov. Po treh dneh so sevi dosegli zgodnjo fazo β-laktamske produkcije. V njej pride do spremembe v izražanju genov – zniža se izražanje genov, ki vplivajo na vegetativno rast in poviša izražanje genov v sekundarnem metabolizmu. Iz gliv so izolirali RNA in jo sekvenirali. S primerjano analizo izražanja genov so spremljali razliko v ravneh izražanja genov divjega tipa ter industrijskega seva. Ker so v predhodnih raziskavah ugotovili, da naj bi bilo izražaje genov v biosintezni poti β-laktamov močno regulirano preko produktov gena velvet, so preverili raziskovalci preverili tudi, kakšen je transkriptom sevov z delecijo tega gena. Na podlagi pridobljenih podatkov so nato gene razdelili v štiri funkcionalne skupine in nadalje v podskupine.


Rezultati in zaključek

Pri P. chrysogenum so identificirali 748 genov, katerih izražanje se je v divjem tipu in industrijskem sevu razlikovalo. To predstavlja 6,7 % vseh anotiranih protein-kodirajočih genov. 357 (47.7%) genom se je raven izražanja povišala, 391(52.3%) pa znižala. Pri A. chrysogenum so identificirali 1572 genov s spremembo v izražanju, kar ustreza 17% anotiranih protein-kodirajočih genov. Odstotki ravni povišanega in znižanega izražanja so bili podobni kot pri P. chrysogenum; 797 (50.7%) se je raven izražanja povišala, 775 (49.3%) pa znižala. Primerjava sevov z delecijo gena velvet je potrdila njegovo pomembno vlogo v celičnem metabolizmu. Gen zapisuje za podenote kompleksa Velvet, ki sodeluje v približno polovici procesov sekundarnega celičnega metabolizma obeh gliv. Raziskovalci so po analizi zaključili, da kompleks pri P. chrysogenum približno v enaki meri deluje kot pozitivni in negativni regulator metabolizma, pri A. chrysogenum pa je v 89% genom raven izražanja znižala, zato je v tem sevu bolj v vlogi negativnega regulatorja sekundarnega metabolizma. Funkcijska analiza je pokazala, da je v obeh glivah v industrijskih sevih prišlo do spremenjenega izražanja genov primarnega in sekundarnega metabolizma (npr. v metabolizmu aminokislin), kar bi lahko bila posledica spremenjenih potreb sevov v zagotavljanju energije za produkcijo β-laktamov. Pri teh sevih je prav tako prišlo do znižanih ravni izražanja genov, povezanih s celičnim transportom, obrambo in virulenčnostjo. Ker industrijski sevi rastejo v stalnih pogojih, imajo lahko manjše izražanje genov za različne transporterje in proteine, ki drugače sodelujejo v celičnem odzivu na stres.

Raziskava je nakazala smernice za usmerjeno mutagenezo in pripravo novih industrijskih genov.

Personal tools