Antihipertenzivni probiotik - nov pristop zniževanja krvnega tlaka

From Wiki FKKT

Revision as of 18:56, 19 April 2020 by Nika Testen (Talk | contribs)
Jump to: navigation, search

Antihipertenzivni probiotik kot nov pristop zniževanja krvnega tlaka je projekt študentske ekipe Shenzhen Polytechnic (SZPT) iz Kitajske, s katerim so leta 2019 nastopili na tekmovanju iGEM. Cilj ekipe je bil razvoj probiotičnega zdravila, ki bi se uporabljalo za zdravljenje hipertenzije.

Spletna stran projekta: https://2019.igem.org/Team:SZPT-CHINA

Contents

Uvod - hipertenzija

Hipertenzija ali visok krvni tlak je pogosta kronična bolezen žil, pri kateri simptomi navadno niso izraženi, vseeno pa vpliva na povišano tveganje za nastanek srčnožilnih bolezni (srčnega infarkta, možganske kapi idr.). Po podatkih Svetovne zdravstvene organizacije zaradi zapletov hipertenzije vsako leto umre približno 9,4 milijonov ljudi po vsem svetu. Zdravljenje je zato nujno potrebno.

Pri regulaciji krvnega tlaka je pomemben sistem renin – angiotenzin – aldosteron. Osrednji encim, povezan s hipertenzijo, je angiotenzin konvertaza (ACE), ki katalizira pretvorbo angiotenzina I (AngI) v angiotenzin II (AngII). Slednji je močan vazokonstriktor, zato ima velik učinek na zviševanje krvnega tlaka. Za zdravljenje hipertenzije se tako pogosto uporabljajo inhibitorji ACE.

Cilj članov ekipe je bil razvoj antihipertenzivnega probiotičnega zdravila.

Dizajn antihipertenzivnih peptidov

Zasnovali so 10 visoko aktivnih hipertenzivnih peptidov (AHP) z uporabo tehnologije prstnega odtisa na osnovi proteinskih struktur. Gre za metodo, ki pomaga preučevati konformacijo proteinov. AHP so nato sintetizirali in analizirali njihovo in vitro aktivnost. Ta je bila ovrednotena s parametrom IC50; čim manjšo vrednost ima parameter, tem večja je aktivnost zniževanja krvnega tlaka.

Skupno so za izbrali 5 visoko aktivnih AHP-jev: dva izmed njih sta novo dizajnirana peptida KYLCY in FKGKYYP, ostale tri VY, IPP in VPP pa so izbrali na podlagi obstoječe baze podatkov o antihipertenzivnih peptidih. Aktivne peptide AHP so z argininskimi linkerji (FR) v več ponovitvah povezali v neaktivne multimere (AHPM), dolge 78 aminokislin. Te linkerje so izbrali zato, ker predstavljajo cepitveno mesto prebavnih encimov, po hidrolizi pa tako nastane veliko število hipotenzivnih peptidov.

Regulacija izražanja AHP

Za regulacijo izražanja rekombinantnega proteina AHPM v gostiteljski celici so uporabili pH-inducirani promotor rcfB, represor LacR ter operatorje O1 in O2, ki delujejo po sledečem principu:

(1) Ko se zunajcelični pH zmanjša pod vrednost 5,5, pH-inducirani promotor rcfB zazna spremembo kislosti in sproži ekspresijo represorja LacR. Slednji se nato veže na operatorska gena O1 in O2, kar zavre izražanje gena za AHPM.

Tako so preprečili, da bi se AHPM po zaužitju razgradil že v želodcu.

(2) Ko se zunajcelični pH dvigne nad vrednost 5,5, pH-inducirani promotor rcfB ne sproži ekspresije represorja LacR. Represor LacR se razgradi in sprosti operatorska gena O1 in O2, gen za AHPM pa se začne izražati.

S tem so omogočili, da začne gostiteljska celica izražati gen za AHPM šele v črevesju. Tam prebavna encima tripsin in kimotripsin hidrolizirata AHPM v aktivne monomere AHP. Aktivnost ACE je torej inhibirana, saj lahko AHP vstopajo v krvni obtok preko črevesne sluznice. V tem primeru AngI ni spremenjen v AngII, krvni tlak ni povišan in cilj je dosežen.

Kljub temu, da so antihipertenzivne peptide povezali v multimer, je njihova molekulska masa še vedno le okoli 10 kDa, kar bi predstavljalo težavo pri biosintezi in vivo. Zato so se odločili, da uporabijo dve strategiji fuzijske ekspresije, za kar so uporabili dve različni fuzijski oznaki: glutation transferazo (GST) in globulin iz semen amaranta (A11Sg) - izkazalo se je, da ta daje boljše rezultate.

Ekspresija A11SG-AHPM v mlečnokislinskih bakterijah

Gen za A11Sg-AHPM so vstavili v ekspresijski vektor pET-28a(+). Rekombinantne plazmide pET-28a(+)-A11Sg-AHPM so nato vnesli v E. Coli in uspešno transformirane bakterije selekcionirali na ploščah, ki so vsebovale 50 μg/mL kanamicina. Celice so nato inducirali z IPTG in izvedli SDS-PAGE ter prenos western. Fuzijski protein A11Sg-AHPM so očistili z afinitetno kromatografijo. Zmes A11Sg in AHP peptidov so pridobili s hidrolizo tripsina. Dobljena vrednost IC50 je 1,28 mg/mL.

A11Sg-AHPM so nato vstavili v mlečnokislinski ekspresijski vektor pMG36e. Da bi omogočili izločanje fuzijskega proteina v črevesje, so ga povezali s sekretornim signalnim peptidom SPusp45. Poleg tega so za uporabo pH-uravnanega promotorja, ki regulira izražanje A11Sg-AHPM, vstavili tudi operater O1/O2, ki je bil združen z represorjem LacR. Uspešnost konstrukcije rekombinantnega ekspresijskega vektorja so potrdili z restrikcijsko analizo in PCR.

Pripravljen vektor so z elektroporacijo vstavili v bakterijo Lactococcus Lactis. Slednja predstavlja dober gostiteljski mehanizem brez potenciala za infekcijo in patogenost. Bakterije so nato gojili na GM17 mediju. Fermentacijsko brozgo so detektirali z SDS-PAGE. Uspešnost izločanja SPusp45 so dokazali s proteinsko elektroforezo.

Za določevanje in vitro aktivnosti fermentacijskega supernatanta mlečnokislinski bakterij so slednjega hidrolizirali s tripsinom in α-kimotripsinom. A11Sg-AHPM proteina ni bilo mogoče očistiti, zato so po fermentaciji supernatant neposredno hidrolizirali in analizirali aktivnost. Za kontrolo so uporabili mlečnokislinske bakterije LAB MG1363 z vstavljenim vektorjem pMG36e. IC50 supernatanta LAB MG1363 z vstavljenim vektorjem pMG36e-A11Sg-AHPM, je bil 4,8 mg / ml. Primerjava IC50 s kontrolnim supernatantom pokaže, da ima fermentacijski supernatant LAB MG1363 z vstavljenim vektorjem pMG36e-A11Sg-AHPM veliko višjo inhibitorno kot kontrolna skupina. Iz tega je razvidno, da se fuzijski protein z antihipertenzivnim peptidom lahko izloča zunaj celice in po encimski hidrolizi kaže antihipertenzivni učinek.

Da bi preprečili razgradnjo AHPM v prenizkem pH, so v mlečnokislinsko bakterijo MG1363 vstavili gen PrcfB-LacR (P-L). Po tem, ko so konstruirali sistem za regulacijo z vodikovimi ioni, so rekombinantne bakterije gojili v različnih pH medijih. Z eksperimenti so pokazali, da pri pH <5,5 skoraj ni izražanja fuzijskega proteina, ekspresija fuzijskih proteinov je vidna le pri pH> 5,5. Nakazuje, da lahko mehanizem za regulacijo vodikovih ionov igra vlogo v rekombinantnem LAB MG1363.

Izražanje gena NisI v Lactococcus Lactis MG1363: Delovanje biološke šasije je potrebno dokončno oceniti v črevesju. Zato so potrebovali ekspresijski vektor, odporen na hrano*. Gen za odpornost na eritromicin originalnega plazmida pMG36e so zamenjali z genom za odpornost na nisin nisI. Kot je prikazano na sliki 15, rezultat restrikcije in PCRja kažeta, da je bil nisI z velikostjo 856 bp uspešno vstavljen v pMG36e. Rekombinantni vektor je bil poimenovan pMG36N.

Mlečnokislinske bakterije MG1363, v katere je bil prenesen vektor pMG36N, so na nanesli ploščo z nisinom in eritromicinom. Rezultat je prikazan na sliki 16; vidimo lahko, da bi rekombinantni sev lahko zrasel na plošči, odporni na nisin, na plošči, odporni na eritromicin pa ne, kar kaže na to, da je bila zamenjava gena za odpornost uspešna.

Rezultat je pokazal, da je rast mlečnokislinskih bakterij MG1363 ter mlečnokislinskih bakterij MG1363 z vektorjem pMG36e, močno inhibirana v gojišču GM17 z nisinom, medtem ko je LAB MG1363, prenesen s pMG36N, še vedno rastel zelo dobro. To je pokazalo, da je gen nisI, ki kodira lipoprotein nisin, izražen v MG1363 in daje odpornost na nisin v tem sevu. Vseeno pa se pri povečevanju koncentracije nisina tudi rast tega seva zmanjšuje.

Samomorilni mehanizem

Ker uporaba transgenskih bakterij v prehrambeni industriji, kjer je mogoče, da pride do nekontroliranega sproščanja genskega materiala v okolje, predstavlja tveganje, so oblikovali poseben varnostni sistem - samomorilni mehanizem. Za delovanje so uporabili encim N-acetilamuramidazo (acmA), ki je glavni avtolizin bakterije L. Lactis. Zamislili so si naslednji mehanizem: ko se probiotiki izločajo z blatom, v okolju začne primanjkovati glukoze. To sproži promotor T-αcrp, da prekomerno izrazi gen acmA.

V eksperimentu so transgenske bakterije izpostavili različnim koncentracijam glukoze. Z rezultati so pokazali, da je pri manj kot 0,05 % koncentraciji glukoze v okolju rast bakterij znatno inhibirana.

Biokocke

Za namen projekta so uporabili 16 biokock, ki jih lahko razdelimo v 3 kategorije:

(I) biokocke za pH senzorje: promotor PrcfB (Ba_K3142000), laktozni operator O1/O2 (BBa_K3142001), Lac represor LacR (BBa_K3142015) in sestavljena biokocka PrcfB + LacR (BBa_K3142002),

(II) biokocke za ekspresijo AHP: argininski linker FR (Ba_K3142003), 11S globulin iz amaranta A11Sg (Ba_K3142004), antihipertenzivni peptidi VY (Ba_K3142005), IPP (Ba_K3142006), VPP (Ba_K3142007), KYLCY (Ba_K3142008) in FKGKYYP (Ba_K3142009), sestavljena biokocka za antihipertenzivni peptidni multimer AHPM (Ba_K3142010) ter sestavljena biokocka A11Sg-AHPM (Ba_K3142011) in

(III) biokocke, povezane z avtolizo mlečnokislinskih bakterij: promotor PT-αCRP (Ba_K3142012), N-acetilmuramidaza acmA (Ba_K3142013) in sestavljena biokocka PT-αCRP + acmA (Ba_K3142014).

Zaključek

Viri

Personal tools