View source for BI(OIL)OGICAL FACTORY - sistem za proizvodnjo sestavin palmovega olja v mikroalgi

[https://2019.igem.org/Team:Sorbonne_U_Paris BI(OIL)OGICAL FACTORY], ali bi(olje)loška tovarna, je večkrat nominiran iGEM projekt iz leta 2019. Ekipo sestavlja skupina šestnajstih študentk in študentov Univerze Sorbone v Parizu, Francija, ki izhajajo iz različnih izobraževalnih smeri, naravoslovnih in družboslovnih. Poglavitni cilj projekta je bi razviti proteinski sistem znotraj fotosintetske zelene mikroalge ''Chlamydomonas reinhardtii'' za proizvodnjo palmitinske in oleinske kisline, glavni komponenti palmovega olja.

Avtorica povzetka: Dunia Sahir

=='''Palmovo olje'''==
Palmovo olje je najpogosteje uporabljeno rastlinsko olje na svetu, njegova proizvodnja šteje več kot 60 bilionov ton letno<ref>United States Department of Agriculture, Palm Oil Production by Country in 1000 MT, Index Mundi. (2019). https://www.indexmundi.com/agriculture/?commodity=palm-oil&graph=production. [dostop 19.04.2020] </ref>. Proizvajanje palmovega olja neizmerno škoduje okolju in je vzrok za rušenje mnogih ekosistemov zaradi deforestacije. Najbolj na udaru so orangutani, saj izvirajo ravno iz Indonezije in Malezije, kjer sta proizvodnja palmovega olja, in posledično deforestacija, največji. Izredno obsežna gozdnata območja so posekana in nadomestijo jih palmovi nasadi.

=='''Projekt bi[olje]oška tovarna'''==
V sklopu projekta si je skupina študentov želela doseči dvoje: okarakterizirati delovanje označevalca HiBiT za uporabo v ''C. reinhardtii'', da bi ga lahko vključili v že obstoječ Modular Cloning (MoClo)<ref> Crozet, Pierre, et al. "Birth of a photosynthetic chassis: A MoClo toolkit enabling synthetic biology in the microalga ''Chlamydomonas reinhardtii''." ACS synthetic biology 7.9 (2018): 2074-2086.</ref> kit za sinteznobiološko uporabo v mikroalgi in pripraviti konstrukte za spremembno naravnega metabolizma lipidov v ''C. reinhardtii'' z uvedbo novih encimov, ki bi povišali raven izražanja palmitinske in oleinske kisline.

=== Encimi ===
Encimi, ki so jih prvotno izbrali zato, da bi spremenili metabolno pot lipidov v ''C. reinhardtii'' vsi izvirajo iz palme ''Elaeis guineensis''. Encimi so FAT (fatty acid thioesterase), ki je ključen pri terminaciji podaljševanja verige maščobne kisline, ker cepi kovalentno vez med MK in Acil prenašalnim proteinom (ACP) – tako se sinteza ustavi in sprosti se prosta MK<ref>Li-Beisson, Y., Beisson, F. & Riekhof, W. Metabolism of acyl-lipids in ''Chlamydomonas reinhardtii''. The Plant Journal 82, 504–522 (2015). </ref>, LPAAT (lysophosphatidic acid acyltrasferase) vključi drugo maščobno kislino na sn-2 mesto na glicerolu<ref>Li-Beisson, Y., Beisson, F. & Riekhof, W. Metabolism of acyl-lipids in ''Chlamydomonas reinhardtii''. The Plant Journal 82, 504–522 (2015). </ref> in nazadnje DGAT (diacylglycerol acyltransferase), ki vključi tretjo MK na mesto sn-3 na glicerolu<ref> Xiao, Y., Xia, W., Mason, AS., Cao, Z., Fan, H., Zhang, B., Zhang, J., Ma, Z., Peng, M., Huang, D. Genetic control of fatty acid composition in coconut (''Cocos nucifera''), African oil palm (''Elaeis guineensis''), and date palm (''Phoenix dactylifera''). Planta. 2019 Feb, 249 (2), 333-350. </ref>.

=== ''Chlamydomonas reinhardtii'' ===
Kot modelni organizem so izbrali mikroalgo ''Chlamydomonas reinhardtii'', zaradi svojih okolju prijaznih lastnosti, saj je to miksotrofen organizem, ki lahko porabi več ogljikovega dioksida, kot ga proizvede. Pri izbiri je bilo predvsem pomembno, da alga lahko akumulira triacilglicerole (TAG) v obliki lipidnih kapljic. Alga naravno že sama po sebi sintetizira glavni komponenti palmovega olja – palmitinsko in oleinsko kislino. Cilj je bil torej sprememba metabolizma v prid produkcije večje količine lipidov palmovega olja, dodatno pa preprečiti naslednji korak v metabolizmu, kjer alga iz želenih prekurzorjev proizvede polinenasičene maščobne kisline. 

=='''Načrtovanje konstruktov'''==
Celice ''C. reinhardtii'' so želeli spremeniti tako, da bi vplivali na naravno metabolno pot proizvajanja lipidov. Za doseganje cilja in v biosintezne namene so uporabili Golden Gate<ref>Engler C, Kandzia R, Marillonnet S (2008) A One Pot, One Step, Precision Cloning Method with High Throughput Capability. PLoS ONE 3(11): e3647. doi:10.1371/journal.pone.0003647. </ref> Modular Cloning (MoClo) tehnologijo<ref> Weber E, Engler C, Gruetzner R, Werner S, Marillonnet S (2011) A Modular Cloning System for Standardized Assembly of Multigene Constructs. PLoS ONE 6(2): e16765. doi:10.1371/journal.pone.0016765</ref>, s katero so najprej sestavili konstrukte do ravni M v celicah E. coli in jih kasneje prenesli v celice ''C. reinhardtii''. MoClo kit, ki so ga uporabili, je posebno načrtovan za delovanje konstruktov v mikroalgi<ref> Crozet, Pierre, et al. "Birth of a photosynthetic chassis: A MoClo toolkit enabling synthetic biology in the microalga ''Chlamydomonas reinhardtii''." ACS synthetic biology 7.9 (2018): 2074-2086.</ref>.

=== Registrirane biokocke ===
Skupina je letos deponirala štiri [[osnovne dele]] v register biokock. Dva osnovna dela služita kot HiBiT označevalca za N-konec ([http://parts.igem.org/Part:BBa_K2909000 BBa_K2909000]) in C-konec ([http://parts.igem.org/Part:BBa_K2909001 BBa_K2909001]). Ostala dva sta edini kodirajoči zaporedji za encime od prvotnih štirih, ki so ju uspešno klonirali v celice mikroalge, torej encima LPAAT-A ([http://parts.igem.org/Part:BBa_K2909002 BBa_K2909002]) in DGAT1-2 ([http://parts.igem.org/Part:BBa_K2909003 BBa_K2909003]) iz E. Guineensis. Vsi osnovni deli so standardizirani za uporabo v C. reinhardtii MoClo kitu in imajo mesta za restrikcijo z Bbs1 ter pripadajoča fuzijska mesta.

Deponirali so tudi enajst [[sestavnih delov]], ki so jih uporabili za transformacijo C. reinhardtii. Pet delov so ustvarili za karakterizacijo C- in N-končnih HiBiT oznak ([http://parts.igem.org/Part:BBa_K2909004 BBa_K2909004], [http://parts.igem.org/Part:BBa_K2909005 BBa_K2909005], [http://parts.igem.org/Part:BBa_K2909006 BBa_K2909006], [http://parts.igem.org/Part:BBa_K2909007 BBa_K2909007], [http://parts.igem.org/Part:BBa_K2909008 BBa_K2909008]). Štiri dele so uporabili za karakterizacijo izražanja encimov ([http://parts.igem.org/Part:BBa_K2909009 BBa_K2909009], [http://parts.igem.org/Part:BBa_K2909010 BBa_K2909010], [http://parts.igem.org/Part:BBa_K2909011 BBa_K2909011], [http://parts.igem.org/Part:BBa_K2909012 BBa_K2909012]). Dva dela pa sta bila načrtovana za spremembo metabolizma mikroalge ([http://parts.igem.org/Part:BBa_K2909013 BBa_K2909013] in [http://parts.igem.org/Part:BBa_K2909014 BBa_K2909014]). Ta dva dela ne sledita osnovnemu načrtu, saj ne vsebujeta zapisa za encim FAT.

=='''Eksperimentalni del in rezultati'''==

=== Sestavljanje plazmidov ===

[[Sestavljanje konstruktov s HiBiT označevalcem]]

Naročili so dve oligonukleotidni zaporedji za N- in C-končni HiBiT označevalec, da bi lahko z njim označili proteine, izražene v C. reinhardtii. Zapisa za označevalec so kot osnovne dele vstavili v plazmida ravni 0 in ju sekvencirali, da bi preverili ustreznost začetnih naročenih oligonukleotidov. Iz osnovnih delov so s pomočjo MoClo kita sestavili več plazmidov ravni M, v katerih so bili geni za rezistenco proti paromomicinu in geni za izražanje različno označenih GFP proteinov. Dobili so plazmide za izražanje GFP-ja, označenega z HiBiT na N- (pCMM-1) in C-koncu (pCMM-2), označenega z NanoLuc na N- (pCMM-4) in C-koncu (pCMM-5) ter GFP brez označevalca (pCMM-3), vse z istim selekcijskim markerjem. Vse plazmide so linearizirali z restriktazo Bsa1 in potrdili prisotnost vstavka z agarozno gelsko elektroforezo. 


[[Sestavljanje konstruktov z encimi]]

Uporabili so podoben postopek kot pri karakterizaciji HiBiT, saj so tudi tu naročili oligonukleotidna zaporedja encimov in jih z MoClo načinom sestavljanja združili v plazmide, ki so vključevali zapis za protein, označenim s HiBiT. Od naročenih oligonukleotidov za encime FAT-A, FAT-B2, DGAT in LPAAT so dobili je DGAT in LPAAT, saj je bilo ostala dva nemogoče sintetizirati zaradi prevelike vsebnosti gvaninov in citozinov. Na koncu so torej uspešno nastali plazmidi za izražanje DGAT z N- (pCMM-6) ali C-končno (pCMM-7) HiBiT oznako, LPAAT z N- (pCMM-8) ali C- končno (pCMM-9)) HiBiT oznako in še plazmid z zapisom za oba proteina z N- (pCMM-14) ali C-končno (pCMM-15) HiBiT.

=== Okarakterizacija osnovnih delov ===

[[HiBiT označevalec]]

Želeli so dokazati ustreznost detekcije in kvantifikacije izražanja proteinov, v tem primeru GFP, označenih z HiBiT označevalcem v C. reinhardtii. Pred transformacijo mikroalge so DNA rezali z Bsa1, da bi z linearno DNA transformirali celice. Po elektroporaciji so celice gojili na gojišči z paromomicinom in nitratom (aktivacija NIT1 promotorja). Po dodatku LgBiT in luciferina so merili bioluminescenco in tako ugotovili, v katerih kolonijah je bil izražen označen protein.
Za validacijo NIT1 promotorja so spremljali izražanje označenega GFP-ja v gojiščih, v katera so dodali nitrat kot aktivator in gojiščih, kamor so dodali amonijak, ki naj bi imel represorsko vlogo. Vse paralelke so kazale pričakovane rezultate razen ene, ki je kazala lastnosti regulacije pod konstitutivnim promotorjem. Sklepali so, da se je ta gen vstavil v regijo, regulirano s konstitutivnim promotorjem, ki je prevladal nad regulacijo s NIT1 promotorjem inserta. Preverili so tudi odvisnost luminescence od števila celic, ko so dodali nitrat ali amonijak v gojišče. V vseh primerih je zveza linearno naraščala. Najbolj učinkovito izražanje kaže transformanta s pCMM2 vektorjem (GFP s C-končnim HiBiTom) - verjetno so se zato v nadajevanju osredotočili na delo s C-končnimi oznakami. Kjer je bil v gojišče dodan amoniak je luminiscenca minimalno narasla s številom celic in bila vseskozi veliko nižja, kot ob dodatku nitrata, kar je potrdilo negativen regulatorni vpliv na NIT1.

[[DGAT in LPAAT]]

Želeli so ugotoviti, ali pride do izražanja encima z uporabo HiBiT oznake in merjenjem bioluminescence. Celice C. reinhardtii so transformirali z lineariziranimi vektorji ravni M z elektroporacijo in celice gojili na gojišču s higromicinom in nitratom. Pri celicah transformiranih s konstrukti, ki vsebujejo zapis za oba encima, so lahko izmerili le vsoto prispevkov vsakega encima k bioluminescenci, kar jim ni omogočilo, da bi potrdili izražanje vsakega encima posebej.
Tudi v tem primeru so preverili še izražanje v odvisnosti od vira dušika, ki vpliva na NIT1 promotor. Pri dveh klonih so opazili, da se encimi izražajo konstitutivno, torej neodvisno od vira dušika (M7, M15).

=== Sprememba lipidnega metabolizma ===

[[Pogoji celične kulture]]

Celice so najprej gojili v mediju, ki je vseboval nitrat zato, da bi aktivirali izražanje pod NIT1 promotorjem, potem pa so po večkratnem spiranju prenesli celice v medij brez vira dušika zato, da bi spodbudili kopičenje triacilglicerolov<ref>Deng, Xiaodong, Xiaowen Fei, and Yajun Li. "The effects of nutritional restriction on neutral lipid accumulation in Chlamydomonas and Chlorella." African Journal of Microbiology Research 5, no. 3 (2011): 260-270.</ref>. Po šestih dneh v stanju dušikovega stradanja je večina celic umrla. Zato so nadaljne eksperimente naredili v mediju z amonijakom, da bi opazovali vpliv DGAT in LPAAT na lipidni profil v normalnih pogojih, saj so za to izbrali celice, za katere so ugotovili, da izražajo encime neodvisno od vira dušika.

[[Izražanje encima]]

S pomočjo HiBiT sistema so preverili, ali je izražanje encimov v izbranih vzorcih ustrezna. Potrdili so, da klon M7 izraža DGAT in klon M15 izraža vsaj enega izmed DGAT in LPAAT encimov. 

[[Sprememba lipidnega profila]]

Za proučevanje spremembe metabolizma lipidov so uporabili tankoplastno kromatografijo<ref> H.K. Mangold, Lectu,es of tZe 1961 New.. Lipid Analyses Thin-Layer Chromatography of Lipids, n.d. </ref>, kjer so kot standarde uporabili znane maščobne kisline, triacilglicerole in diacilglicerole. Nanosu lipidov klona M7, v katerem je izražen le DGAT, manjka ena lisa, ki pripada diacilglicerolom, v primerjavi z divjim tipom, kar kaže, da je lipidni profil postal bolj podoben profilu palmovega olja. To sovpada z mehanizmom delovanja DGAT, ki poveča porabo diacilglicerolov v prid drugim lipidom. Lipidni profil klona M15 je ostal zelo podoben profilu celicam divjega tipa. Ker je iz prejšnjih analiz razvidno, da ta klon izraža vsaj enega izmed encimov sklepajo, da v večji meri izraža LPAAT, medtem ko DGAT izraža premalo, da bi bila povečana poraba diacilglicerolov. LPAAT ne spremeni profila, bi pa moral povečati koncentracijo diacilglicerolov. Alternativen sklep je bil, da celice izražajo oba encima, a da povečanje diacilglicerolov zaradi LPAAT navidezno izniči porabo zaradi DGAT.

=='''Zaključek'''==
V sklopu projekta je skupina želela ozavestiti javnost o okoljevarstveni problematiki uporabe palmovega olja, dodatno pa javnosti približati temo GSO, ki lahko ob premišljeni uporabi predstavljajo rešitev za marsikateri okoljski ali drug problem. V ta namen so poleg samega sinteznobiološkega dela pripravili še strip in video igrico ter praktične poskuse izvajali v srednjih šolah in na konferencah.

== '''Viri''' ==
<references/>