BNU- Kitajska: inženirski črevesni mikrobi za zmanjševanje debelosti: Difference between revisions

From Wiki FKKT
Jump to navigationJump to search
(https://2019.igem.org/Team:BNU-China; BNU- Kitajska: inženirski črevesni mikrobi za zmanjševanje debelosti)
 
No edit summary
Line 1: Line 1:
<ref>[https://2019.igem.org/Team:BNU-China] https://2019.igem.org/Team:BNU-China</ref> ''https://2019.igem.org/Team:BNU-China'' BNU- Kitajska: inženirski črevesni mikrobi za zmanjševanje debelosti
Avtorica povzetka: Sara Jereb
== UVOD ==
== UVOD ==
Debelost je vse bolj opazna težava po celem svetu. Opredeljena je kot zdravstveno stanje, pri katerem se odvečna telesna maščoba kopiči do te mere, da ima negativne posledice na telo. Debelost je določena, ko indeks telesne mase preseže 30kg/m2. Med negativne posledice, ki so povezane z debelostjo spadajo večina bolezni srca in ožilja, več vrst raka in predvsem krčenje življenjske dobe.  
Debelost je vse bolj opazna težava po celem svetu. Opredeljena je kot zdravstveno stanje, pri katerem se odvečna telesna maščoba kopiči do te mere, da ima negativne posledice na telo. Debelost je določena, ko indeks telesne mase preseže 30kg/m2. Med negativne posledice, ki so povezane z debelostjo spadajo večina bolezni srca in ožilja, več vrst raka in predvsem krčenje življenjske dobe.  
Line 17: Line 21:


== MODUL ZA PROIZVODNJO ACETATA ==
== MODUL ZA PROIZVODNJO ACETATA ==
Kot način za povečanje porabe asimilirane maščobe, se uvede pot za prekomerno proizvodnjo acetata, ki služi kot signal za aktivacijo porabe človeškega belega maščobnega tkiva, saj zavira sintezo maščobnih kislin, poveča oksidacijo maščobnih kislin in izločanje lipidov. (1) Da bi povečali proizvodnjo acetata v omenjenih mikrobih so prekomerno izrazili dva encima: fosfotransacetilazo (PTA) in acetokinazo (ACK) iz genov, ki izhajata iz genoma E.Coli K-12. Acetil-CoA so uporabili kot substrat, preko katerega poteče visoko učinkovita dvostopenjska encimska reakcija s katero kataliziramo produkcijo ocetne kisline. Kodirna zaporedja fosfotransacetilaze (PTA) in acetokinaze (ACK) sta vstavljena navzdol od ustreznih RBS in  sta urejena zaporedno kot policistron pod kontrolo lac promotorja. Ko poteče indukcija, se PTA in ACK izrazita in s tem se sproži prekomerna proizvodnja ocetne kisline. PTA katalizira pretvorbo acetil-CoA v acetil fosfat, nakar encim ACK katalizira pretvorbo slednjega v acetat.  
Kot način za povečanje porabe asimilirane maščobe, se uvede pot za prekomerno proizvodnjo acetata, ki služi kot signal za aktivacijo porabe človeškega belega maščobnega tkiva, saj zavira sintezo maščobnih kislin, poveča oksidacijo maščobnih kislin in izločanje lipidov.<ref>Liu L., Fu C., Li F. Acetate Affects the Process of Lipid Metabolism in Rabbit Liver, Skeletal Muscle and Adipose Tissue. Animals (Basel). '''2019''', 9(10), 799</ref> Da bi povečali proizvodnjo acetata v omenjenih mikrobih so prekomerno izrazili dva encima: fosfotransacetilazo (PTA) ([http://parts.igem.org/Part:BBa_K3036002 BBa_K3036002]) in acetokinazo (ACK)([http://parts.igem.org/Part:BBa_K3036001 BBa_K3036001]) iz genov, ki izhajata iz genoma E.Coli K-12. Acetil-CoA so uporabili kot substrat, preko katerega poteče visoko učinkovita dvostopenjska encimska reakcija s katero kataliziramo produkcijo ocetne kisline ([http://parts.igem.org/Part:BBa_K3036007 BBa_K3036007]). Kodirna zaporedja fosfotransacetilaze (PTA) in acetokinaze (ACK) sta vstavljena navzdol od ustreznih RBS in  sta urejena zaporedno kot policistron pod kontrolo lac promotorja. Ko poteče indukcija, se PTA in ACK izrazita in s tem se sproži prekomerna proizvodnja ocetne kisline. PTA katalizira pretvorbo acetil-CoA v acetil fosfat, nakar encim ACK katalizira pretvorbo slednjega v acetat.  
=== Senzor, ki nadzoruje aktivacijo acetatne poti ===
 
Inhibitorni promotor je potrebno vključiti pred potjo prekomerne produkcije acetata, da zagotovimo samodejno izključitev poti med potekom prebave. Na voljo je več kandidatov, vključno z promotorjem glukoznega zaviranja rpoH P5 in maščobni acil-CoA inhibitorni promotor fabB. (2)
=== Senzor, ki nadzoruje aktivacijo acetatne poti ===  
Inhibitorni promotor je potrebno vključiti pred potjo prekomerne produkcije acetata, da zagotovimo samodejno izključitev poti med potekom prebave. Na voljo je več kandidatov, vključno z promotorjem glukoznega zaviranja rpoH P5 ([http://parts.igem.org/Part:BBa_K3036003 BBa_K3036003]) in maščobni acil-CoA inhibitorni promotor fabB.<ref>parts.igem.org/Part:BBa_K30360033</ref>
 
== MODUL ZA IZBOLJŠANJE β-OKSIDACIJE  ==
== MODUL ZA IZBOLJŠANJE β-OKSIDACIJE  ==
Raziskovalci želijo doseči, da inženirske bakterije porabijo večji delež zaužitih maščob. Maščoba, ki je privzeta v črevesju se najprej hidrolizira v glicerol in višje maščobne kisline, nakar se absorbirajo v krvni obtok. Višje maščobne kisline vsebujejo največ energije, zato je smiselno spodbuditi razgradnjo le-teh na manjše maščobne kisline. V ta namen se prekomerno izrazi dva encima, ki sodelujeta pri β-oksidaciji višjih maščobnih kislin: maščobno acil-CoA sintetazo (FadD) in maščobno acil-CoA dehidrogenazo (FadE). Oba encima izhajata iz genoma E.Coli K-12. Povečanje β-oksidacije poveča tudi nastanek acetil-CoA, ki je substrat za proizvodnjo acetata.
Raziskovalci želijo doseči, da inženirske bakterije porabijo večji delež zaužitih maščob. Maščoba, ki je privzeta v črevesju se najprej hidrolizira v glicerol in višje maščobne kisline, nakar se absorbirajo v krvni obtok. Višje maščobne kisline vsebujejo največ energije, zato je smiselno spodbuditi razgradnjo le-teh na manjše maščobne kisline. V ta namen se prekomerno izrazi dva encima, ki sodelujeta pri β-oksidaciji višjih maščobnih kislin: maščobno acil-CoA sintetazo (FadD)([http://parts.igem.org/Part:BBa_K861010 BBa_K861010]) in maščobno acil-CoA dehidrogenazo (FadE) ([http://parts.igem.org/Part:BBa_K861020 BBa_K861020]). Oba encima izhajata iz genoma E.Coli K-12. Povečanje β-oksidacije poveča tudi nastanek acetil-CoA, ki je substrat za proizvodnjo acetata.
 
== DVOSTRANSKO STIKALO ==  
== DVOSTRANSKO STIKALO ==  
Obe opisani biokemijski poti s katerimi se želi zmanjšati količino telesne maščobe imata različni optimalni čas delovanja. Za proizvodnjo acetata je bolje, da se med prebavo ne izrazi, saj bi njegov proizvod, ocetna kislina spremenila pH prebavnih sokov in tako motila delovanje prebavnih encimov. Najboljši čas sprožitve β-oksidacije pa je med prebavo, saj se med prebavo zaužitega obroka poveča količina višjih maščobnih kislin v prebavilih.  
Obe opisani biokemijski poti s katerimi se želi zmanjšati količino telesne maščobe imata različni optimalni čas delovanja. Za proizvodnjo acetata je bolje, da se med prebavo ne izrazi, saj bi njegov proizvod, ocetna kislina spremenila pH prebavnih sokov in tako motila delovanje prebavnih encimov. Najboljši čas sprožitve β-oksidacije pa je med prebavo, saj se med prebavo zaužitega obroka poveča količina višjih maščobnih kislin v prebavilih.  
Za usklajevanje razlike med obema časovnicama so v sistem vključili dvostransko stikalo, da bakterije v danem času izrazijo ustrezno biokemijsko pot. V bakterijo se vnese rekombinantni sistem, ki vključuje:  
Za usklajevanje razlike med obema časovnicama so v sistem vključili dvostransko stikalo, da bakterije v danem času izrazijo ustrezno biokemijsko pot. V bakterijo se vnese rekombinantni sistem, ki vključuje:  


- Zapis za bakteriofagno integrazo (Bxb1) (3)
- Zapis za bakteriofagno integrazo (Bxb1) <ref>parts.igem.org/Part:BBa_K9070003</ref>


- Zapis za njen rekombinacijski usmeritveni faktor (RDF)  
- Zapis za njen rekombinacijski usmeritveni faktor (RDF)  
Line 33: Line 40:
Gen RDF je pod nadzorom inducibilnega promotorja, ki spreminja raven izražanja glede na prisotnost prebavnega signala. Koncentracija integraze pa se med tem ohranja na konstantni ravni, zato je pod nadzorom konstituitivnega promotorja (omogoča nenehno izražanje gena). Usmerjenost sistema (ali se generirajo mesta attB/attP ali mesta attL/attR) se določi z prilagoditvijo razmerja izražanja integraze in RDF. Pomembno je torej, da se delež RDF lahko hitro poveča in hitro pade in tako zagotovi hitro uravnavanje sistema, zato mora biti inducibilni promotor zelo močan.  
Gen RDF je pod nadzorom inducibilnega promotorja, ki spreminja raven izražanja glede na prisotnost prebavnega signala. Koncentracija integraze pa se med tem ohranja na konstantni ravni, zato je pod nadzorom konstituitivnega promotorja (omogoča nenehno izražanje gena). Usmerjenost sistema (ali se generirajo mesta attB/attP ali mesta attL/attR) se določi z prilagoditvijo razmerja izražanja integraze in RDF. Pomembno je torej, da se delež RDF lahko hitro poveča in hitro pade in tako zagotovi hitro uravnavanje sistema, zato mora biti inducibilni promotor zelo močan.  
Konstitutivni promotor, ki je obdan z mestoma prepoznavanja attB in attP je nato postavljen med proizvodno potjo acetata in β-oksidacijsko potjo. Ko je izražena le integraza, promotor sproži proizvodnjo acetata; ko sta izražena tako integraza kot RDF, se promotor obrne, da aktivira β-oksidacijo.
Konstitutivni promotor, ki je obdan z mestoma prepoznavanja attB in attP je nato postavljen med proizvodno potjo acetata in β-oksidacijsko potjo. Ko je izražena le integraza, promotor sproži proizvodnjo acetata; ko sta izražena tako integraza kot RDF, se promotor obrne, da aktivira β-oksidacijo.
=== Izboljšava sistema ===  
=== Izboljšava sistema ===  
Da bi povečali učinkovitost dvostranskega stikala, se lahko na konec zaporedja RDF pripne oznaka 16 aminokislin dolg replikacijski protein A (RepA). Dodatna oznaka ne sme vplivati na rekombinacijo, zato je bil ustvarjen proteinski umestitveni model. N in C konca sta oba oddaljena od vezavne površine proteinov, tako da bi dodajanje oznake na kateregakoli od njiju vplivalo na nastanek dimera. Vseeno so za dodatek RepA izbrali N-konec RDF proteina zaradi manjše verjetnosti zgube te oznake zaradi nesmiselne mutacije.
Da bi povečali učinkovitost dvostranskega stikala, se lahko na konec zaporedja RDF pripne oznaka 16 aminokislin dolg replikacijski protein A (RepA). Dodatna oznaka ne sme vplivati na rekombinacijo, zato je bil ustvarjen proteinski umestitveni model. N in C konca sta oba oddaljena od vezavne površine proteinov, tako da bi dodajanje oznake na kateregakoli od njiju vplivalo na nastanek dimera. Vseeno so za dodatek RepA izbrali N-konec RDF proteina zaradi manjše verjetnosti zgube te oznake zaradi nesmiselne mutacije.
=== Induktivni senzor ===  
=== Induktivni senzor ===  
Z ustreznim senzorjem, ki je občutljiv na prebavni signal, omogoči dvostranskemu stikalu, da preklaplja med obema biokemijskima potema s kontroliranjem prisotnosti ali odsotnosti RDF. Upošteva se lahko več prebavnih signalov – glukoza, žolčne kisline, višje maščobne kisline itd. Več možnih promotorjev je torej na voljo za izpolnitev te naloge. Narejen je bil eksperiment, kjer so preverili prag delovanja glukoznega promotorja rpoH P5. Rezultat je pokazal, da se promotor odzove na zelo majhne spremembe koncentracije glukoze v črevesju in sicer pri 0,01% in 0,05%. Dvostransko stikalo lahko damo pod nadzor promotorja rpoH P5 za namen senzorja prebave.
Z ustreznim senzorjem, ki je občutljiv na prebavni signal, omogoči dvostranskemu stikalu, da preklaplja med obema biokemijskima potema s kontroliranjem prisotnosti ali odsotnosti RDF. Upošteva se lahko več prebavnih signalov – glukoza, žolčne kisline, višje maščobne kisline itd. Več možnih promotorjev je torej na voljo za izpolnitev te naloge. Narejen je bil eksperiment, kjer so preverili prag delovanja glukoznega promotorja rpoH P5. Rezultat je pokazal, da se promotor odzove na zelo majhne spremembe koncentracije glukoze v črevesju in sicer pri 0,01% in 0,05%. Dvostransko stikalo lahko damo pod nadzor promotorja rpoH P5 za namen senzorja prebave.
== KOLONIZACIJSKI OZ. PROMOCIJSKI MODUL ==
== KOLONIZACIJSKI OZ. PROMOCIJSKI MODUL ==
Za uspešno kolonizacijo bakterij v človeškem črevesju, je nujno, da se naravno prisotni mikrobi ne izključujejo z inženirskimi, prav tako, da inženirski mikrobi ne posegajo preveč v črevesni mikrobiom. Izbran je bil probiotični sev E. Coli Nissle 1917, ki je pridobljen iz človeškega črevesja, zato ne sproži imunskega odziva. S prekomernim izražanjem encima glukoza dehidrogenaze (GDH), ključnega encima na pentoza fosfatni poti, se poveča proliferacija celic, ki omogoči boljšo konkurenčnost. Slednji encim lahko torej uporabimo za pospeševanje kolonizacije našega mikroba.  
Za uspešno kolonizacijo bakterij v človeškem črevesju, je nujno, da se naravno prisotni mikrobi ne izključujejo z inženirskimi, prav tako, da inženirski mikrobi ne posegajo preveč v črevesni mikrobiom. Izbran je bil probiotični sev E. Coli Nissle 1917, ki je pridobljen iz človeškega črevesja, zato ne sproži imunskega odziva. S prekomernim izražanjem encima glukoza dehidrogenaze (GDH), ključnega encima na pentoza fosfatni poti, se poveča proliferacija celic, ki omogoči boljšo konkurenčnost. Slednji encim lahko torej uporabimo za pospeševanje kolonizacije našega mikroba.  
=== Izboljšava ===  
=== Izboljšava ===  
Po drugi strani pa ne želimo, da bi ta mikrob motil naravno prisotni mikrobiom, zato so vključili sistem zaznavanja kvoruma, ki je odvisen glede na prisotnost naravno prisotnih mikrobov. Z omejitvijo sistema zaznavanja kvoruma, inženirske bakterije upočasnijo njihovo proliferacijo v trenutku, ko dosežejo določen prag populacije, kar zagotavlja, da ne ovira črevesnega mikrobioma.  
Po drugi strani pa ne želimo, da bi ta mikrob motil naravno prisotni mikrobiom, zato so vključili sistem zaznavanja kvoruma, ki je odvisen glede na prisotnost naravno prisotnih mikrobov. Z omejitvijo sistema zaznavanja kvoruma, inženirske bakterije upočasnijo njihovo proliferacijo v trenutku, ko dosežejo določen prag populacije, kar zagotavlja, da ne ovira črevesnega mikrobioma.
== BIOLOŠKA VARNOST ==  
== BIOLOŠKA VARNOST ==  
Biološka varnost je zelo pomembno vprašanje, če želimo kolonizirati baterije v človeškem črevesju. Zasnovali so dva varnostna modula in preizkušena za dve različni uporabi.  
Biološka varnost je zelo pomembno vprašanje, če želimo kolonizirati baterije v človeškem črevesju. Zasnovali so dva varnostna modula in preizkušena za dve različni uporabi.  
=== Nadzor nad kolonizacijo ===
=== Nadzor nad kolonizacijo ===
Ko se mikrobi kolonizirajo v človeškem črevesju, bi radi, da ostane sistem pod našim nadzorom, da se omogoči prenehanje uporabe. V ta namen se vstavi gen, ki omogoči odstranjevanje bakterij tako, da kodira translacijski inhibitor (MazF), navzdol od z L-arabinozo induciranega promotorja. L-arabinoza je neškodljiva za človeško telo in jo je mogoče neposredno zaužiti preko prebavnega sistema. Uporabljena je zato, ker je v prehrani raven le-te zelo nizka, zato je majhna verjetnost, da se ubijanje celic sproži naključno. MazF je sicer zaviralec translacije in ne povzroča lize celic, zato ne škodi naravno prisotnemu mikrobiomu v črevesju.
Ko se mikrobi kolonizirajo v človeškem črevesju, bi radi, da ostane sistem pod našim nadzorom, da se omogoči prenehanje uporabe. V ta namen se vstavi gen, ki omogoči odstranjevanje bakterij tako, da kodira translacijski inhibitor (MazF)([http://parts.igem.org/Part:BBa_K302033 BBa_K302033]), navzdol od z L-arabinozo induciranega promotorja ([http://parts.igem.org/Part:BBa_K3036005 BBa_K3036005]). L-arabinoza je neškodljiva za človeško telo in jo je mogoče neposredno zaužiti preko prebavnega sistema. Uporabljena je zato, ker je v prehrani raven le-te zelo nizka, zato je majhna verjetnost, da se ubijanje celic sproži naključno. MazF je sicer zaviralec translacije in ne povzroča lize celic, zato ne škodi naravno prisotnemu mikrobiomu v črevesju.
 
=== Ubijalsko stikalo ===  
=== Ubijalsko stikalo ===  
Preprečiti je potrebno, da inženirske bakterije ne okužijo okolja zunaj človeškega telesa. Za to so uporabili sistem toksin-antitoksin. Vstavljen gen kodira toksičen protein (ReIE), ki povzroči inhibicijo sinteze proteinov v celici, njegov antitoksin pa je termolabilni protein ReIB. Gena za slednja proteina sta povezana v stalno izraženem policistronu. Translacija gena toksina ReIE je promovirana z navadnim RBS, medtem ko izražanje antitoksina ReIB promovira temperaturno občutljiv RBS. Ko se inženirske bakterije nahajajo v človeškem črevesju je temperatura okolice 37℃ in izražanje antitoksina ReIB je popolno (toksin ReIE je nevtraliziran z antitoksinom ReIB). Ko pa se inženirske bakterije izločijo iz telesa, temperatura pade in izražanje antitoksina ReIB se inhibira. Posledično bakterije umrejo kot posledica prevelikega izražanja toksina ReIE in tako prepreči kontaminacijo okolja. (4)
Preprečiti je potrebno, da inženirske bakterije ne okužijo okolja zunaj človeškega telesa. Za to so uporabili sistem toksin-antitoksin. Vstavljen gen kodira toksičen protein (RelE)([http://parts.igem.org/Part:BBa_K185047 BBa_K185047]), ki povzroči inhibicijo sinteze proteinov v celici, njegov antitoksin pa je termolabilni protein RelB ([http://parts.igem.org/Part:BBa_K185048 BBa_K185048]). Gena za slednja proteina sta povezana v stalno izraženem policistronu. Translacija gena toksina RelE je promovirana z navadnim RBS, medtem ko izražanje antitoksina RelB promovira temperaturno občutljiv RBS ([http://parts.igem.org/Part:BBa_K3036004 BBa_K3036004]). Ko se inženirske bakterije nahajajo v človeškem črevesju je temperatura okolice 37℃ in izražanje antitoksina RelB je popolno (toksin RelE je nevtraliziran z antitoksinom RelB). Ko pa se inženirske bakterije izločijo iz telesa, temperatura pade in izražanje antitoksina RelB se inhibira. Posledično bakterije umrejo kot posledica prevelikega izražanja toksina RelE in tako prepreči kontaminacijo okolja. <ref>4. parts.igem.org/Part:BBa_K185047</ref>
 
=== Izboljšava ===
=== Izboljšava ===
Da bi pospešili hitrost smrti celic za najvišjo možno varnost, se lahko antitoksinu RelB doda oznako RepA, ki spodbuja razgradnjo, zaradi česar antitoksinu onemogoči hitro razstrupljaje RelE.  
Da bi pospešili hitrost smrti celic za najvišjo možno varnost, se lahko antitoksinu RelB doda oznako RepA ([http://parts.igem.org/Part:BBa_K3036008 BBa_K3036008]), ki spodbuja razgradnjo, zaradi česar antitoksinu onemogoči hitro razstrupljaje RelE.  
Naredili so tudi proteinski umestitveni model RelB in RelE, da bi identificirali kateri RelB konec je najbolj primeren za dodano oznako, brez da bi ta vplivala na rekombinacijo med antitoksinom in toksinom. Reultat je pokazal, da je N-konec RelB disociativen, C-konec pa je blizu vezavne površine. Zato je N-konec RelB boljša izbira.
Naredili so tudi proteinski umestitveni model RelB in RelE, da bi identificirali kateri RelB konec je najbolj primeren za dodano oznako, brez da bi ta vplivala na rekombinacijo med antitoksinom in toksinom. Reultat je pokazal, da je N-konec RelB disociativen, C-konec pa je blizu vezavne površine. Zato je N-konec RelB boljša izbira.
== ZAKLJUČEK ==  
== ZAKLJUČEK ==  
Znanstveniki so se projekta lotili zelo celostno. Po osnovni zasnovi projekta so poiskali pomoč in svetovanje priznanih strokovnjakov na različnih področjih, ki so povezani z debelostjo, ter si izmenjevali znanje in izkušnje z mnogimi raziskovalnimi ekipami. Raziskali so trg prehranskih dodatkov, ki služijo kot shujševalni pripravki, prav tako so se pogovarjali z bolniki, ki trpijo za debelostjo in naredili številne raziskave, analize in vprašalnike o prehrani in debelosti v mestu in na deželi. Narejeno je bilo mnogo eksperimentov z namenom izboljšave sistema in preverjanje delovanja teoretičnih modulov.
Znanstveniki so se projekta lotili zelo celostno. Po osnovni zasnovi projekta so poiskali pomoč in svetovanje priznanih strokovnjakov na različnih področjih, ki so povezani z debelostjo, ter si izmenjevali znanje in izkušnje z mnogimi raziskovalnimi ekipami. Raziskali so trg prehranskih dodatkov, ki služijo kot shujševalni pripravki, prav tako so se pogovarjali z bolniki, ki trpijo za debelostjo in naredili številne raziskave, analize in vprašalnike o prehrani in debelosti v mestu in na deželi. Narejeno je bilo mnogo eksperimentov z namenom izboljšave sistema in preverjanje delovanja teoretičnih modulov. Projekt ima torej veliko potenciala, da kot celosten sistem pristopi k tako zahtevni težavi kot je previsoka telesna teža.
 
== '''Viri''' ==
<references/>

Revision as of 23:22, 17 May 2020

<ref>[1] https://2019.igem.org/Team:BNU-China</ref> https://2019.igem.org/Team:BNU-China BNU- Kitajska: inženirski črevesni mikrobi za zmanjševanje debelosti

Avtorica povzetka: Sara Jereb

UVOD

Debelost je vse bolj opazna težava po celem svetu. Opredeljena je kot zdravstveno stanje, pri katerem se odvečna telesna maščoba kopiči do te mere, da ima negativne posledice na telo. Debelost je določena, ko indeks telesne mase preseže 30kg/m2. Med negativne posledice, ki so povezane z debelostjo spadajo večina bolezni srca in ožilja, več vrst raka in predvsem krčenje življenjske dobe.

Rešitev

Raziskovalci predlagajo razvitje črevesnih mikrobov (synthetic-promoting intestinal microbe (SLIM)), katere bi kolonizirali v človeškem črevesju in bi promovirali katabolizem maščobe preko dveh biokemijskih poti. Vpliv mikroorganizmov na zdravje ljudi se že dogo raziskuje. Dokazano je, da imajo vpliv na različne dejavnike, kot je metabolizem, na biološke pregrade, imunsko reguliranje itd. Mikroorganizmi s skrbno zasnovanimi lastnostmi bi tako posredovali v procese, ki se odvijajo pri debelosti na najbolj direkten način. Raziskava je zasnovana na naslednjih modulih:

- Modul za proizvodnjo acetata

- Senzor, ki nadzoruje aktivacijo acetatne poti

- Modul za izboljšanje β-oksidacije

- dvostransko stikalo

- Kolonizacijski oz. promocijski modul

- Dva varnostna modula

MODUL ZA PROIZVODNJO ACETATA

Kot način za povečanje porabe asimilirane maščobe, se uvede pot za prekomerno proizvodnjo acetata, ki služi kot signal za aktivacijo porabe človeškega belega maščobnega tkiva, saj zavira sintezo maščobnih kislin, poveča oksidacijo maščobnih kislin in izločanje lipidov.<ref>Liu L., Fu C., Li F. Acetate Affects the Process of Lipid Metabolism in Rabbit Liver, Skeletal Muscle and Adipose Tissue. Animals (Basel). 2019, 9(10), 799</ref> Da bi povečali proizvodnjo acetata v omenjenih mikrobih so prekomerno izrazili dva encima: fosfotransacetilazo (PTA) (BBa_K3036002) in acetokinazo (ACK)(BBa_K3036001) iz genov, ki izhajata iz genoma E.Coli K-12. Acetil-CoA so uporabili kot substrat, preko katerega poteče visoko učinkovita dvostopenjska encimska reakcija s katero kataliziramo produkcijo ocetne kisline (BBa_K3036007). Kodirna zaporedja fosfotransacetilaze (PTA) in acetokinaze (ACK) sta vstavljena navzdol od ustreznih RBS in sta urejena zaporedno kot policistron pod kontrolo lac promotorja. Ko poteče indukcija, se PTA in ACK izrazita in s tem se sproži prekomerna proizvodnja ocetne kisline. PTA katalizira pretvorbo acetil-CoA v acetil fosfat, nakar encim ACK katalizira pretvorbo slednjega v acetat.

Senzor, ki nadzoruje aktivacijo acetatne poti

Inhibitorni promotor je potrebno vključiti pred potjo prekomerne produkcije acetata, da zagotovimo samodejno izključitev poti med potekom prebave. Na voljo je več kandidatov, vključno z promotorjem glukoznega zaviranja rpoH P5 (BBa_K3036003) in maščobni acil-CoA inhibitorni promotor fabB.<ref>parts.igem.org/Part:BBa_K30360033</ref>

MODUL ZA IZBOLJŠANJE β-OKSIDACIJE

Raziskovalci želijo doseči, da inženirske bakterije porabijo večji delež zaužitih maščob. Maščoba, ki je privzeta v črevesju se najprej hidrolizira v glicerol in višje maščobne kisline, nakar se absorbirajo v krvni obtok. Višje maščobne kisline vsebujejo največ energije, zato je smiselno spodbuditi razgradnjo le-teh na manjše maščobne kisline. V ta namen se prekomerno izrazi dva encima, ki sodelujeta pri β-oksidaciji višjih maščobnih kislin: maščobno acil-CoA sintetazo (FadD)(BBa_K861010) in maščobno acil-CoA dehidrogenazo (FadE) (BBa_K861020). Oba encima izhajata iz genoma E.Coli K-12. Povečanje β-oksidacije poveča tudi nastanek acetil-CoA, ki je substrat za proizvodnjo acetata.

DVOSTRANSKO STIKALO

Obe opisani biokemijski poti s katerimi se želi zmanjšati količino telesne maščobe imata različni optimalni čas delovanja. Za proizvodnjo acetata je bolje, da se med prebavo ne izrazi, saj bi njegov proizvod, ocetna kislina spremenila pH prebavnih sokov in tako motila delovanje prebavnih encimov. Najboljši čas sprožitve β-oksidacije pa je med prebavo, saj se med prebavo zaužitega obroka poveča količina višjih maščobnih kislin v prebavilih. Za usklajevanje razlike med obema časovnicama so v sistem vključili dvostransko stikalo, da bakterije v danem času izrazijo ustrezno biokemijsko pot. V bakterijo se vnese rekombinantni sistem, ki vključuje:

- Zapis za bakteriofagno integrazo (Bxb1) <ref>parts.igem.org/Part:BBa_K9070003</ref>

- Zapis za njen rekombinacijski usmeritveni faktor (RDF)

Integraza prepozna svoja dva mesta prepoznavanja attB in attP na dvojni vijačnici DNA, invertira zaporedje DNK med njima in pretvori attB in attP mesti v dve novi mesti za prepoznavanje attL in attR (v odsotnosti RDF). Reverzno reakcijo pa povzroči protein RDF, saj sistem integraza-RDF zavira aktivnost integraze, zato se postopek obrne in generira mesta attB in attP. Gen RDF je pod nadzorom inducibilnega promotorja, ki spreminja raven izražanja glede na prisotnost prebavnega signala. Koncentracija integraze pa se med tem ohranja na konstantni ravni, zato je pod nadzorom konstituitivnega promotorja (omogoča nenehno izražanje gena). Usmerjenost sistema (ali se generirajo mesta attB/attP ali mesta attL/attR) se določi z prilagoditvijo razmerja izražanja integraze in RDF. Pomembno je torej, da se delež RDF lahko hitro poveča in hitro pade in tako zagotovi hitro uravnavanje sistema, zato mora biti inducibilni promotor zelo močan. Konstitutivni promotor, ki je obdan z mestoma prepoznavanja attB in attP je nato postavljen med proizvodno potjo acetata in β-oksidacijsko potjo. Ko je izražena le integraza, promotor sproži proizvodnjo acetata; ko sta izražena tako integraza kot RDF, se promotor obrne, da aktivira β-oksidacijo.

Izboljšava sistema

Da bi povečali učinkovitost dvostranskega stikala, se lahko na konec zaporedja RDF pripne oznaka 16 aminokislin dolg replikacijski protein A (RepA). Dodatna oznaka ne sme vplivati na rekombinacijo, zato je bil ustvarjen proteinski umestitveni model. N in C konca sta oba oddaljena od vezavne površine proteinov, tako da bi dodajanje oznake na kateregakoli od njiju vplivalo na nastanek dimera. Vseeno so za dodatek RepA izbrali N-konec RDF proteina zaradi manjše verjetnosti zgube te oznake zaradi nesmiselne mutacije.

Induktivni senzor

Z ustreznim senzorjem, ki je občutljiv na prebavni signal, omogoči dvostranskemu stikalu, da preklaplja med obema biokemijskima potema s kontroliranjem prisotnosti ali odsotnosti RDF. Upošteva se lahko več prebavnih signalov – glukoza, žolčne kisline, višje maščobne kisline itd. Več možnih promotorjev je torej na voljo za izpolnitev te naloge. Narejen je bil eksperiment, kjer so preverili prag delovanja glukoznega promotorja rpoH P5. Rezultat je pokazal, da se promotor odzove na zelo majhne spremembe koncentracije glukoze v črevesju in sicer pri 0,01% in 0,05%. Dvostransko stikalo lahko damo pod nadzor promotorja rpoH P5 za namen senzorja prebave.

KOLONIZACIJSKI OZ. PROMOCIJSKI MODUL

Za uspešno kolonizacijo bakterij v človeškem črevesju, je nujno, da se naravno prisotni mikrobi ne izključujejo z inženirskimi, prav tako, da inženirski mikrobi ne posegajo preveč v črevesni mikrobiom. Izbran je bil probiotični sev E. Coli Nissle 1917, ki je pridobljen iz človeškega črevesja, zato ne sproži imunskega odziva. S prekomernim izražanjem encima glukoza dehidrogenaze (GDH), ključnega encima na pentoza fosfatni poti, se poveča proliferacija celic, ki omogoči boljšo konkurenčnost. Slednji encim lahko torej uporabimo za pospeševanje kolonizacije našega mikroba.

Izboljšava

Po drugi strani pa ne želimo, da bi ta mikrob motil naravno prisotni mikrobiom, zato so vključili sistem zaznavanja kvoruma, ki je odvisen glede na prisotnost naravno prisotnih mikrobov. Z omejitvijo sistema zaznavanja kvoruma, inženirske bakterije upočasnijo njihovo proliferacijo v trenutku, ko dosežejo določen prag populacije, kar zagotavlja, da ne ovira črevesnega mikrobioma.

BIOLOŠKA VARNOST

Biološka varnost je zelo pomembno vprašanje, če želimo kolonizirati baterije v človeškem črevesju. Zasnovali so dva varnostna modula in preizkušena za dve različni uporabi.

Nadzor nad kolonizacijo

Ko se mikrobi kolonizirajo v človeškem črevesju, bi radi, da ostane sistem pod našim nadzorom, da se omogoči prenehanje uporabe. V ta namen se vstavi gen, ki omogoči odstranjevanje bakterij tako, da kodira translacijski inhibitor (MazF)(BBa_K302033), navzdol od z L-arabinozo induciranega promotorja (BBa_K3036005). L-arabinoza je neškodljiva za človeško telo in jo je mogoče neposredno zaužiti preko prebavnega sistema. Uporabljena je zato, ker je v prehrani raven le-te zelo nizka, zato je majhna verjetnost, da se ubijanje celic sproži naključno. MazF je sicer zaviralec translacije in ne povzroča lize celic, zato ne škodi naravno prisotnemu mikrobiomu v črevesju.

Ubijalsko stikalo

Preprečiti je potrebno, da inženirske bakterije ne okužijo okolja zunaj človeškega telesa. Za to so uporabili sistem toksin-antitoksin. Vstavljen gen kodira toksičen protein (RelE)(BBa_K185047), ki povzroči inhibicijo sinteze proteinov v celici, njegov antitoksin pa je termolabilni protein RelB (BBa_K185048). Gena za slednja proteina sta povezana v stalno izraženem policistronu. Translacija gena toksina RelE je promovirana z navadnim RBS, medtem ko izražanje antitoksina RelB promovira temperaturno občutljiv RBS (BBa_K3036004). Ko se inženirske bakterije nahajajo v človeškem črevesju je temperatura okolice 37℃ in izražanje antitoksina RelB je popolno (toksin RelE je nevtraliziran z antitoksinom RelB). Ko pa se inženirske bakterije izločijo iz telesa, temperatura pade in izražanje antitoksina RelB se inhibira. Posledično bakterije umrejo kot posledica prevelikega izražanja toksina RelE in tako prepreči kontaminacijo okolja. <ref>4. parts.igem.org/Part:BBa_K185047</ref>

Izboljšava

Da bi pospešili hitrost smrti celic za najvišjo možno varnost, se lahko antitoksinu RelB doda oznako RepA (BBa_K3036008), ki spodbuja razgradnjo, zaradi česar antitoksinu onemogoči hitro razstrupljaje RelE. Naredili so tudi proteinski umestitveni model RelB in RelE, da bi identificirali kateri RelB konec je najbolj primeren za dodano oznako, brez da bi ta vplivala na rekombinacijo med antitoksinom in toksinom. Reultat je pokazal, da je N-konec RelB disociativen, C-konec pa je blizu vezavne površine. Zato je N-konec RelB boljša izbira.

ZAKLJUČEK

Znanstveniki so se projekta lotili zelo celostno. Po osnovni zasnovi projekta so poiskali pomoč in svetovanje priznanih strokovnjakov na različnih področjih, ki so povezani z debelostjo, ter si izmenjevali znanje in izkušnje z mnogimi raziskovalnimi ekipami. Raziskali so trg prehranskih dodatkov, ki služijo kot shujševalni pripravki, prav tako so se pogovarjali z bolniki, ki trpijo za debelostjo in naredili številne raziskave, analize in vprašalnike o prehrani in debelosti v mestu in na deželi. Narejeno je bilo mnogo eksperimentov z namenom izboljšave sistema in preverjanje delovanja teoretičnih modulov. Projekt ima torej veliko potenciala, da kot celosten sistem pristopi k tako zahtevni težavi kot je previsoka telesna teža.

Viri

<references/>