View source for BOOM V - bakterijski membranski vezikli za zaščito rastlin pred patogeni

BOOM V je projekt iGEM iz leta 2021, ki ga je naredila skupina študentov iz Univerze v Zürichu. Z njim so se uvrstili na prvo mesto v kategoriji novih pristopov. Želeli so pripraviti okolju in zdravju bolj prijazno alternativo sintetičnim pesticidom, pri čemer so izkoristili naravni imunski sistem rastlin.

Spletna stran projekta BOOM V, iGEM 2021: [https://2021.igem.org/Team:UZurich https://2021.igem.org/Team:UZurich]

Avtorica povzetka: Eva Gartner

=='''Uvod'''==

Število svetovnega prebivalstva vsako leto narašča, s čimer se povečuje problem nezadostne preskrbe s hrano. Vsako leto namreč narašča odstotek ljudi, ki je nimajo dovolj. Soočamo se tudi s pomanjkanjem kmetijskih površin, zato moramo najti način kako pridelati čim več hrane na čim manjši površini. To je glavni razlog, da kmetje uporabljajo vedno večje količine sintetičnih pesticidov za obrambo rastlin pred patogenimi organizmi in posledično uničujejo biodiverziteto ter slabijo zemljo. Skupina študentov iz Švice je pri svojem projektu iskala nov, alternativen pristop, ki bi vplival le na tarčne organizme in ne bi imel negativnih učinkov na okolje in zdravje ljudi [1].

=='''Ideja - BOOM V'''==

Težave s patogenimi organizmi so se lotili na nekoliko drugačen način. Namesto, da bi ciljali direktno na ubijanje patogenov so se odločili, da bodo izkoristili naravni obrambni mehanizem rastlin. Spodbudili bi delovanje rastlinskega imunskega sistema in njenih obrambnih mehanizmov, še preden rastlina pride v stik s patogenom in jo na tak način okrepili in naredili bolj odporno [1].
Njihova ideja je bila, da stimulirajo delovanje PTI (angl. »pattern triggered immunity«). To je prva obrambna linija rastline ob stiku s patogenom, ki se sproži ob prepoznavanju ti. PAMP-ov (angl. »pathogen-associated molecular patterns«), dobro ohranjenih molekul, ki so karakteristične za posamezne skupine patogenov. Prepoznajo jih posebni receptorji na celični membrani, PRR (angl. »patteren recognition receptor«), ki potem aktivirajo PTI. Ta obrambni odziv ni specifičen, ampak se rastlina odzove prek več različnih mehanizmov kot so povečanje koncentracije kalcija, povečana proizvodnjo kisikovih reaktivnih snovi, fitohormonov, spremembo transkriptoma itd. [1, 2, 3]. Problem prenosa imunogenih molekul do rastlin so rešili z uporabo veziklov zunanje membrane (OMV), ki jih naravno proizvajajo gramnegativne bakterije. Prednost, ki jo predstavljajo, je enostaven nastanek in dejstvo, da je njihova sestava enaka sestavi zunanje membrane bakterij, ki jih proizvajajo. Njihov načrt je bil, da imunogene molekule (PAMP-e) izrazijo na zunanji membrani bakterij in jih preko veziklov dostavijo do rastlin [1, 4, 5].

===Razvoj ideje===

Na podlagi predhodnih raziskav so se odločili, da bodo izrazili dve imunogeni molekuli: flagelin-22 (flg22) in N-končni del elongacijskega faktorja Tu (elf18). ). Zanju so se odločili na podlagi literature, saj ti dve molekuli inducirata močan imunski odziv pri več vrstah rastlin. Prenos na zunanjo membrano so dosegli tako, da so ju prek linkerja vezali na membranski protein ClyA, značilen za bakterijo E.coli. Tudi to so izbrali na podlagi predhodnih raziskav. Zaradi nezadostne naravne proizvodnje OMV so za šasijo izbrali bakterijo ''E. coli tolB'', za katero je značilna hipervaskulacija, za večjo imunogenost pa so uporabili sev ''E.coli'' BL21 ''omp8'', pri katerem naj bi se na membrani izrazilo več imunogenih molekul [1].

=='''Načrtovanje konstrukta'''==

Po osnovanju ideje so se lotili načrtovanja konstrukta, s katerim bi transformirali celice. Po premisleku so se odločili, da ne bodo v celoti sintetizirali plazmida, ampak bodo sintetizirali posamezne fragmente, ki jih bodo kasneje ligirali z uporabo sistema Golden Gate.

===Golden Gate===

Kloniranje po sistemu Golden Gate omogoča sintezo več fragmentov DNA in njihovo združitev skupaj z uporabo restriktaz tipa IIS. Te so posebne v tem, da ne režejo v sredini prepoznavnih zaporedij, ampak izven njih in ustvarijo lepljive konce, dolge 4 bp, prek katerih lahko fragmente ligiraš v vektor [6]. Delali so z restriktazama Bsal in Bpil. Za osnovo so vzeli plazmid LII in sintetizirali fragment, ki je vseboval zapis za ClyA ter oznako 3x FLAG ter fragmenta, ki sta zapisovala za imunogeni molekuli. Vse skupaj so ligirali po sistemu Golden Gate. Prednost takega načina izgradnje je, da bi lahko enostavno zamenjali zapis za PAMP-e ali membranski protein, saj imajo različne rastline različno močne odzive na posamezne molekule [1].

===Konstrukt===

Za izgradnjo konstrukta so uporabili že obstoječe biokocke. Pripravljen konstrukt je vseboval:

•	inducibilni promotor pBAD (BBa_I0500)

•	srednje močan RBS

•	zapis za ClyA (BBa_K811000)

•	oznaka 3 x FLAG (BBa_K823034)

•	fleksibilni linker 2 x (GGGGS) (BBa_K1486004)

•	daljši linker 3 x (GGSG) (BBa_K243006)

•	zapis za flg22 (BBa_K3286138)

•	zapis za elf18 (BBa_K3989023)

•	dvojni terminator (BBa_B0010)

Končni vektor je poleg tega konstrukta vseboval še zapis za araC (regulator promotorja, represor v odsotnosti arabinoze in aktivator v prisotnosti arabinoze), mesto začetka replikacije  za E. coli (Col E1) in selekcijski marker za odpornost proti antibiotiku ampicilinu [1].

=='''Rezultati testiranja odziva rastlin na BOOM V'''==

Po načrtovanju konstrukta in transformaciji ''E. coli tolB''  je sledilo testiranje produkta. V prvi fazi so želeli preveriti dve stvari: 

a)	če vezikli, ki jih proizvajajo bakterije, po indukciji z arabinozo res izražajo fuzijski protein na  membrani (preverili z Western Blot) in

b)	če vezikli z izraženimi imunogenimi molekulami res inducirajo imunski odgovor (preverili z dvema testoma: SGI in ROS).

Vse tri teste so izvedli s tremi različnimi izraženimi konstrukti in sicer samo ClyA, ClyA z vezanim elf18 ter ClyA z vezanim flg22.

===Western blot===

Za analizo so s plazmidi transformirali celice E''. coli'' BL21 ''omp8'', ki imajo na membrani izraženih več  konstruktov. Izolirane vezikle so nanesli na gel in prenesli na membrano, ki so jo inkubirali s protitelesi proti oznaki FLAG. V vseh treh primerih so dobili liso pri približno 40 kDa, kar so tudi pričakovali [1].

===Test inhibicije rasti semen (SGI)===

Pri tem testu je merilo za moč imunskega odgovora rast semen. Bolj kot je ta zaustavljena, močnejši je imunski odziv. Pri eksperimentu so uporabili semena modelne rastline ''Arabidopsis thaliana'', za katero je znano, da naj bi elf18 in flg22 močno stimulirala imunski odgovor. Rezultati so pokazali, da vezikli z izraženima fuzijskim proteinoma elf18 in flg22 inducirajo imunski odgovor, ki je močnejši kot pri samem ClyA. Ta imunski odgovor inducira šele pri višjih koncentracijah [1,7].

===Test prisotnosti reaktivnih kisikovih zvrsti (ROS)===

Po prvem pozitivnem rezultatu so naredili še test prisotnosti kisikovih reaktivnih snovi, pri čemer višja koncentracija pomeni močnejši imunski odgovor. Tudi tu so rezultati potrdili, da konstrukti dejansko inducirajo imunski odgovor in pokazali, da elf18 v obeh primerih inducira precej večji odziv. Slednje so pričakovali, saj je ta bolj imunogen za rastline iz družine kamor sodi ''Arabidopsis thaliana''. Vseeno pa odgovor še zdaleč ni bil tako močan kot pri pozitivni kontroli, kar bi lahko poskušali izboljšati z drugim fuzijskim proteinom z več ekstracelularnimi domenami, boljšimi šasijami [1, 7].

=='''Implementacija'''==

Razmišljali so o dveh možnih načinih uporabe: v obliki spreja ali s sprostitvijo gensko modificiranih bakterij (GMO) v okolje.

===Sprej===

Uporaba spreja je za enkrat bolj priljubljen način, saj ne vključuje sprostitve GMO v okolje, vendar ima tudi svoje pomanjkljivosti kot je npr. spiranje z dežjem. Omogoča pa uporabo produkta v državah s strogo regulativo glede uporabe gensko modificiranih organizmov.

===Gensko modificirane bakterije===

Druga ideja je bila, da bi v bakterije implementirali nek inducibilni sistem, ki bi se odzval na prisotnost patogenov oz. nekih signalnih molekul iz razreda AHL, ki so zanje značilne. To bi bile lahko bakterije, ki so pogoste pri rastlinah in imajo nefunkcionalen oz. izbit gen za protein tolB, ki povezuje notranjo in zunanjo celično membrano. Zaradi večje stabilnosti taka bakterija proizvaja manj veziklov zunanje membrane. Te bakterije bi transformirali s tremi vektorji: prvi bi vseboval naš konstrukt, drugi zapis za proteazo TEV pod kontrolo lux promotorja (regulator luxR) in tretji zapis za protein tolB pod kontrolo promotorja PesaR (regulator EsaR). Zapis za protein tolB bi vseboval tri mesta, kjer lahko reže proteaza TEV in v kolikor bi bila ta prisotna, izražen protein ne bi bil funkcionalen. V odsotnosti patogena bi se tolB konstitutivno izražal in bi kompenziral pomanjkanje proteina tolB zaradi izbitega gena. V prisotnosti AHL bi molekula EsaR raje interagirala s tem kot s promotorjem PesaR, zato se bo tolB nehal izražati. Hkrati bi z AHL interagirala tudi molekula luxR, kar bi sprožilo izražanje proteaze, ki bi cepila že prisoten tolB. Koncentracija proteina tolB bi se posledično znižala in začela bi se hipervaskulacija [1].

=='''Zaključek'''==

Študentje so pri opisanem projektu izhajali iz mnenja kmetov, da za uspešno pridelavo hrane nujno potrebujejo zaščito pred patogenimi organizmi, kar pomeni uporabo sintetičnih pesticidov. Kot izziv so si postavili razvoj neke alternative, ki bi rastline prav tako obvarovala pred napadom patogenov, a bi imela manj škodljivih učinkov na okolje in zdravje. Najprej so uspešno induciranje imunskega odgovora potrdili s preprostimi testi v laboratoriju, nadaljevali pa bi s testi na dejanskih poljščinah in optimizacijo celotnega procesa. Za lažje delo skupin, ki bi raziskovale to področje, so naredili tudi obsežno statistično analizo rezultatov. V anketah so dobili pozitivno povratno informacijo kmetov, kar jim je dalo zagon za nadaljnje delo.

=='''Viri'''==

[1] Team: UZurich – 2021.igem.org https://2021.igem.org/Team:UZurich (pridobljeno dne 20. 3. 2022)

[2] Hou, Shuguo et al. “Damage-Associated Molecular Pattern-Triggered Immunity in Plants.” Frontiers in plant science vol. 10 646. 22 May. 2019, doi:10.3389/fpls.2019.00646

[3] Bigeard, J., Colcombet, J. and Hirt, H., 2015. Signaling mechanisms in pattern-triggered immunity (PTI). Molecular Plant, 8(4), pp.521-539.

[4] Li, Ruizhen, and Liu Qiong. "Engineered Bacterial Outer Membrane Vesicles as Multifunctional Delivery Platforms." Frontiers in Materials vol. 7 202. 10. July. 2020, doi:10.3389/fmats.2020.00202

[5] Bahar, Ofir et al. “Bacterial Outer Membrane Vesicles Induce Plant Immune Responses.” Molecular plant-microbe interactions: MPMI vol. 29,5 (2016): 374-84. doi:10.1094/MPMI-12-15-0270-R

[6] Chiasson, D., Giménez-Oya, V., Bircheneder, M., Bachmaier, S., Studtrucker, T., Ryan, J., ... & Parniske, M. (2019). A unified multi-kingdom Golden Gate cloning platform. Scientific reports, 9(1), 1-12

[7] Bredow, M., Sementchoukova, I., Siegel, K., & Monaghan, J. (2019). Pattern-triggered oxidative burst and seedling growth inhibition assays in Arabidopsis thaliana. JoVE (Journal of Visualized Experiments), (147), e59437.