View source for Bakterije, ki kelirajo bakrove ione, v boju proti Wilsonovi bolezni

Probiotic drugs to combat disease - Understanding Wilson's disease<br />
http://2016.igem.org/Team:Oxford

= Uvod =
Cilj Oxfordove skupine na tekmovanju iGEM 2016 je bila priprava probiotičnega terapevtika za zdravljenje Wilsonove bolezni. Za temo so se odločili, ker je to ena izmed redkih bolezni (prisotna je pri 1 od 30000 ljudi) in posledično farmacevtska podjetja nimajo prav nobene želje oz. potrebe po vlaganju sredstev za razvoj tovrstnih zdravil.

= Wilsonova bolezen =
Wilsonova bolezen je genetska bolezen, katere posledica je nezmožnost metabolizma bakra. Pri zdravih ljudeh se baker po zaužitju absorbira v tankem črevu, transportira do jeter in nato v žolč, s katerim se nato izloči. Pri Wilsonovi bolezni pa so prisotne mutacije (tako točkovne, kot tudi delecije, premiki bralnega okvirja in različne variante izrezovanja). Ta zapisuje za baker-prenašalni protein, ki je odgovoren za nalaganje bakra na ceruloplazmin (protein, ki je glavni prenašalec bakra). Posledica je akumulacija bakra v jetrih. Tam reagira z vodikovim peroksidom, pri čemer nastanejo nevarni prosti radikali, ki poškodujejo tkivo. Zaradi te poškodbe lahko nato bakrovi ioni potujejo po krvožilnem sistemu in poškodujejo še druga tkiva.
Z zdajšnimi zdravili pacienti niso zadovoljni, zaradi: a) stranskih efektov, ki naj bi bili včasih precej hudi; b) visoke cene; c) visokih doz zdravil (potrebno vsakodnevno jemanje). 

= Biološki deli =
Cilj je bil pripraviti sistem, ki bo sposoben detekcije bakra in produkcije kelata za keliranje bakra. Za detekcijo so uporabili promotor na bazi E.coli regulatorja bakra CueR in CusS/CusR dvokomponentnega sistema. Kot kelatorja pa so testirali baker-uskladiščevalni protein-1 (Csp1) iz Methylosinus trichosporium in pa metalotionein (MymT) iz Mycobacterium tuberculosis.
== Kelatorji bakra == 
Cilj je bil najti kelatorje, ki lahko vežejo več bakrovih ionov na peptid in morajo biti prokariontskega izvora zaradi izražanja v E.coli. Našli so dva takšna proteina, in pripravili dve biokocki. Vsaka vsebuje po en zapis za kelatorski protein in zapis za super-zviti GFP (fuzija).
=== Baker-skladiščni protein 1 (Csp1) ===
Je protein odkrit pri bakteriji Methylosinus trichosporium OB3. Močno veže bakrove ione, saj je povprečna Kd kar 10-17 M. Proteinski tetramer lahko veže do 52 ionov.  Csp1 je periplazemski protein s signalno sekvenco TAT. V zapisu za protein so optimizirali rabo kodonov za E.coli. Pripravili so tudi fuzijski protein s sfGFP.
=== Mikobakterijski metalotioinein (MymT) ===
Je protein iz Mycobacterium tuberculosis. Je precej manjši od Csp1 in lahko veže do 7 ionov. Pripravili so tudi fuzijski protein s sfGFP.

== Promotorji ==
Cilj je, da se kelator producira samo ob prisotnosti bakra. E.coli ima dva sistema za detekcijo bakra: s CueR povezan sistem, ki detektira citoplazemski baker, in CusS/CusR sistem, ki detektira periplazemski baker.
=== S CueR povezani sistemi === 
CueR je lahko aktivator ali represor, odvisno od koncentracije bakra. Vpliva na interakcijo RNA polimeraze z DNA. Veže se na promotorsko regijo gena copA. Pripravili so štiri promotorske sisteme, temelječe na pCopA: <br />
a) pCopA sfGFP: željene občutljivosti na baker ni bilo zaradi premajhne količine CueR; <br />
b) pCopA sfGFP z divergentnim CueR: ki vsebuje GFP pod pCopA promotorjem in CueR pod konstitutivnim promotorjem;  težava je, da zapisa nista ločena s transkripcijskim terminatorjem (izražanje GFP v odsotnosti bakra)<br />
c) pCopA z divergentnim CueR: podoben prejšnjemu, a se na mesto GFPja lahko vstavi poljuben protein<br />
d) pCopA CueR sfGFP s povratno zanko pCopA sfGFP: pri tem sta CueR in GFP zapisana pod pCopA, kar predstavlja pozitivno povratno zanko.

=== CusS/CusR povezani sistemi ===
Sestavljata jih transmembranska kinaza CusS, ki veže periplazemski baker in citoplazemski regulator odgovora CusR, ki se veže na DNA regijo, ki je prisotna pred CusCFBA operonom (proteini za izvoz bakra) in CusRS operonom (pozitivna povratna zanka). Pripravili so dva sistema:<br />
a) pCusC RFP: V prisotnosti bakra se izraža RFP.<br />
b) pCusC CusR RFP: dodan zapis za CusR (pozitivna povratna zanka). Težava je, da pride pri kloniranju do mutacije, zaradi česar sistem ni bolj občutljiv kot prejšnji. Pri ATG sfGFP je BspH1 mesto, ki omogoča ligacijo poljubnega proteina.

== Sestavljeni deli ==
So deli, sestavljeni iz promotorjev, občutljivih na baker, in zapisov za baker-kelirajoče proteine. Pripravili so tri takšne. CueR je v vseh primerih pod konstitutivnim promotorjem.<br />
a) pCopA MymT z divergentno izraženim CueR <br />
b) pCopA MymT GFP z divergentno izraženim CueR<br />
c) pCopA Csp1 GFP z divergentno izraženim CueR

= Nekaj eksperimentov =
== Karakterizacija promotorjev ==
Za karakterizacijo promotorjev so uporabili tri metode: merjenje fluorescence na čitalcu plošč, pretočno citometrijo in mikroskopijo. Za vse promotorske sisteme so dale vse tri metode konzistentne rezultate. Sistem pCopA sfGFP je bil odziven le na zelo visoke koncentracije bakra. Sistema pCopA MymT sfGFP z divergentim CueR in pCopA Csp1 sfGFP z divergentim CueR sta oba dobro odzivna na baker, vendar pri drugem se pojavi težava v izražanju Csp1 (inkluzijska telesca). Pri sistemu  pCopA CueR sfGFP / pozitivna povratna zanka pCopA sfGFP naj bi CueR deloval kot aktivator, rezultati pa kažejo, da je represor. 
== Kelacija bakra ==
Kelacijo bakra so želeli potrditi z dvema metodama: z reagentom BCS (batodikuproin bisulfat), ter s spremljanjem  trajanja fluorescence (FLIM; fluorescent lifetime imaging). Želeli so preveriti kelacijo bakra tako s celicami, kot z izoliranima proteinoma. BCS deluje tako, da v kompleksu z bakrom absorbira pri 480 nm. S to metodo žal niso uspeli potrditi kelacije bakra, bodisi zaradi neobčutljivosti metode, bodisi zaradi nedelovanja kelatorjev. Druga tehnika temelji na zmanjšanju fluorescence zaradi cepitve GFP-ja s His-oznako, ko je nanjo vezan baker. S to tehniko je bilo pokazano, da MymT kelira bakrove ione.

= Modeliranje in napovedi =
Pripravili so matematične simulacije delovanja njihovih sistemov in efektivnosti bakterij. Osredinili so se na:<br />
a)simulacijo reakcij v bakterijah, za napoved uspešnosti kelacije<br />
b)karakterizacijo promotorjev <br />
c)simulacijo advekcije bakra v črevu<br />
d)simulacijo porazdelitve in naseljevanja bakterij v črevu<br />
Vendar pa so ti modeli zelo zapleteni, zato jih na tem mestu ne bomo razlagali.

= Dostavni sistem =
Pri dostavi je potrebno zagotoviti, da bakterije preživijo pot do tankega čreva. V ta namen so jih obdali z alginatnim ovojem, nato pa izmenično v sloje hitosana in alginata. Cilj je predvsem zaščita pred nizkim pH v želodcu, pri bolj alkalnem pH v tankem črevu pa se mora ovoj razgraditi in bakterije pričnejo naseljevati okolico.

= Preizkus koncepta =
Želja avtorjev naloge je bila predvsem, da je vsaj ena naprava občutljiva na baker, in da se ob prisotnosti bakra inducira izražanje proteina. To jim je uspelo pri biokocki BBa_K1980012 (pCopA MymT sfGFP z divergentnim CueR), kar so dokazali s tremi različnimi metodami: merjenjem fluorescence, pretočno citometrijo in mikroskopijo. Z uporabo čitalca plošč so merili so spremembo fluorescence v času, in s tem posredno količino izraženega GFP-ja pri različnih koncentracijah bakra. Eksperimenti so bili izvedeni pri 37°C, pH 7 in mešanju 225 rpm, kar je dober približek pogojem v tankem črevu. Za omenjeni sistem so pokazali, da je fluorescenca po štirih urah višja z večjo koncentracijo bakra. Tak rezultat so dobili tudi z uporabe pretočne citometrije. Z mikroskopijo pa so pokazalo, da se GFP v prisotnost bakra izraža v citoplazmi, kot je bilo predpostavljeno.
 
= Rezultati =
Tekom raziskovalnega dela so prišli do naslednjih rezultatov: <br />
a) pri različnih uporabah tako s CueR povezanih, kot tudi s CusS/CusR povezanih promotorskih sistemov je povsod dokazana občutljivost na različne koncentracije bakrovih ionov; <br />
b) MymT lahko kelira baker in vivo; <br />
c) dostavni sistem z izmenjujočim hitosanom in alginatom uspešno zaščiti bakterije do tankega čreva, kjer se razgradi.

= Zaključki =
Tekom raziskave je bilo pokazano, da je uporabljeni način potencialno primeren za zdravljenje Wilsonove bolezni. En od izzivov na poti do uspešnega terapevtika, pa je sama narava le-tega. Tehnično bi namreč spadal pod probiotike, to so mikroorganizmi, ki so vnešene v telo z namenom pozitivnega delovanja. Trenutno pa so probiotiki obravnani kot prehransko dopolnilo, ta pa ne potrebujejo odobritve s strani FDA (American food and drug administration). Terapevtik na podlagi gensko spremenjenih bakterij pa bi potreboval odobritev FDA na podlagi kliničnih študij. 
Vsekakor rezultati študije kažejo dober potencial za razvoj terapevtika, prav tako pa tudi sam način razvoja terapevtikov. Bo pa preteklo še kar nekaj časa, preden bi se morebitni tovstni terapevtiki pričeli zares razvijati in uporabljati, predvsem zaradi gonje proti gensko spremenjenim organizmom, ki pa so osnova tovrstnega pristopa k zdravljenju.
Cilji ekipe za prihodnost so nadgraditi svoje delo na višji nivo, da ne bi ostalo le pri preizkusu koncepta (proof of concept). Njihove želje so:<br /> a) karakterizirati kelacijo bakra s Csp1 in potrditev lokalizacije Csp1 v periplazmi;<br /> b) prenesti sistem iz DH5 v sev, ki je bolj podoben bakterijam prebavil;<br /> c) razviti in uporabiti sistem logičnih vrat za dodatni varnostni mehanizem.

= Viri =
http://2016.igem.org/Team:Oxford/Model


[http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Seminarji_SB_12016/17 Kazalo seminarjev 2016/2017]