BeeYeast

Estonijska podiplomska (postgraduate) ekipa EstoniaTUIT je leta 2023 na iGEM tekmovanju s projektom BeeYeast osvojila glavno nagrado v svoji skupini. Njihov projekt je dostopen na povezavi: https://2023.igem.wiki/estonia-tuit/home Avtor povzetka: Mateja Milošević

Uvod

Medonosna čebela ima velik ekološki, gospodarski in kulturni pomen v človeški civilizaciji. Spadajo med najpomembnejše opraševalce rastlin in so nujne za ohranjanje biodiverzitete. Medonosne čebele oprašujejo 80 odstotkov vseh cvetočih rastlin, vključno z več kot 130 vrstami sadja in zelenjave [1, 2]. Z ekonomske strani so tudi zelo pomembne kot komercialni opraševalci, kjer je njihova tržna vrednost samo v Združenih državah Amerike ocenjena na približno 15–20 milijard dolarjev na leto, svetovno pa čebele kot glavni opraševalci rastlin zagotavljajo 153 milijard evrov, kar predstavlja 9,5 % skupne ekonomske vrednosti kmetijske proizvodnje, ki se neposredno uporablja za človeško hrano [1, 3]. Na žalost, populacije medenih čebel se po vsem svetu zmanjšujejo. Vzroke za odmiranje čebel prepisujejo manjšanju biodiverzitete rastlin, povečanju uporabe pesticidov in med-vrstnem prenosu patogenov in parazitov. Za največje izgube čebeljih družin so odgovorne parazitske pršice iz rodu Varroa, ki prenašajo virus deformiranih kril (ang. Deformed wing virus, DWV) [1,2]. Pršice se hranijo na čebeljih zalegah in pri tem nenamerno prenašajo DWV. Poleg tega pršice oslabijo imunski sistem čebel, zaradi česar so bolj dovzetne za okužbe z DWV. Posledično, kombinacija infestacij Varroa pršic in DWV močno vpliva na čebelje družine, kar vodi v motnje v koloniji in predstavlja pomembno grožnjo populacijam opraševalcev in kmetijskim ekosistemom. Trenutne prakse za preprečevanje ali obvladovanje virusnih okužb, kot je uporaba pesticidov, ne zagotavljajo zadostnih rezultatov za ustavitev upadanja populacij čebel [1, 2, 4, 5].

Imunski sistem čebel

Protivirusni obrambni mehanizmi medonosne čebele vključujejo interferenčno RNA (iRNA), kaskade prenosa signala, ki jih sprožijo PAMP-i (ang. pathogen associated molecular patterns) in generiranje reaktivnih kisikovih zvrsti [6]. Ob okužbi z virusom DWV, ki je RNA virus [7], je značilna prisotnost dolgih dsRNA v citosolu okužene celice, kar pa ni tipični produkt evkariontov, zato jih gostitelj prepozna kot molekule PAMP. Prvi korak je cepitev dolgih dsRNA z encimom RNAza III, ki je podoben proteinu Dicer. Dolge dsRNA molekule se cepijo na majhne interferenčne RNA (ang. small interfering RNA; siRNA) dolžine 21-22 baznih parov. Molekule siRNA se nato vežejo na protein Argonaut, ki je del kompleksa utišanja RNA (ang. RNA induced silencing complex; RISC). Obdrži se ena veriga molekule siRNA (vodilna veriga), ki se uporabi pri specifičnem ciljanju sorodnih sekvenc virusnih genomov in njihovi cepitvi [1, 5]. Ta proces vodi do cepitve virusne RNA, s čimer se virusu prepreči podvajanje. Ustvarjanje siRNA kot naravni imunski odziv čebel bi zaviralo izražanje virusnih proteinov, vendar to ni dovolj [1].

Rešitev

iGEM skupina EstoniaTUIT v svojem projektu želi onemogočiti izražanje virusnih proteinov v celicah čebel tako, da bi inducirali iRNA odziv. Strategija vključuje gensko spremenjene celice kvasovk, ki izražajo siRNA, ki za tarčo imajo genom virusa DWV. Gensko spremenjene kvasovke bi dostavili čebelam kot hrano ali z vbrizgavanjem ekstrakta, ki vsebuje siRNA direktno v satje. Cilj je kopičiti siRNA v čebelah kako bi čebele bile bolj pripravljene na okužbo in jih tako zaščititi pred virusom [1]. Kvasovka Saccharomyces Cerevisae nima naravnega mehanizma za proizvodnjo iRNA. Z izražanjem ključnih komponenti za proizvodnjo iRNA (proteina Dicer in Argonaut) iz sorodne kvasovke Saccharomyces castellii bi dosegli učinkovito izražanje željenih konstruktov siRNA proti virusu DWV. Konstrukti se vnesejo v celice s plazmidom in se izrazijo v obliki kratke-lasnične RNA (ang. short-hairpin RNA, shRNA), ki nadalje reže protein Dicer v siRNA. Konstrukte lahko oblikujejo in optimizirajo z in silico pristopih, tako da so čim bolj specifični. Test učinkovitosti konstruktov siRNA je narejen tako, da je tarčno zaporedje virusa fuzirano s kodirajočim zaporedjem za zeleni fluorescentni protein (GFP) z namenom merjenja učinkovitosti inhibicije. V principu, čim bolj učinkovit je konstrukt siRNA bo manjša raven izražanja GFP-ja, ker je prišlo do RNA interference in posledično do utišanja tega gena. Sistem se lahko uporablja za iskanje najboljših kandidatov za siRNA proti virusu DWV in se lahko potencialno razširi za presejanje drugih učinkovitih ciljnih zaporedij drugih virusnih patogenov [1].