Biološko vezje na osnovi RNA-interference za identifikacijo specifičnih rakavih celic

From Wiki FKKT
Revision as of 22:31, 8 December 2018 by Gašper (talk | contribs)
(diff) ← Older revision | Latest revision (diff) | Newer revision → (diff)
Jump to navigationJump to search
The printable version is no longer supported and may have rendering errors. Please update your browser bookmarks and please use the default browser print function instead.

Izhodiščni članek: Z. Xie, L. Wroblewska, L. Prochazka, R. Weiss, Y. Benenson. Multi-input RNAi-based logic circuit for identification of specific cancer cells. Science. 2011, 333, 1307–1311

UVOD

Sinteznobiološki sistemi, ki integrirajo vhodne podatke, jih procesirajo in na osnovi tega sprožijo točno določen celični odziv, so zelo uporabni. Med drugim bi jih lahko izkoristili v protirakave namene.

VEZJE: CELIČNI »RAZVRŠČEVALEC«

V osnovi gre za biološko vezje, ki integrira informacije več različnih bioloških markerjev, specifičnih za raka (tj. lahko promotor, miRNA, mRNA ali protein). Na ta način vezje določi, v kakšnem stanju se nahaja celica in po potrebi sproži izražanje ustreznega proteinskega izhodnega signala.

Skupina raziskovalcev več prestižnih univerz je razvila regulatorno vezje, t.i. celični »razvrščevalec« (ang. cell-type »classifier«), ki zaznava ravni izražanja šestih endogenih miRNA in ugotavlja, ali nivo izražanja le-teh ustreza vnaprej določenemu profilu izražanja (v celicah HeLa). Če pride do ujemanja profila izražanja, vezje sproži apoptozo, sicer pa se ne zgodi nič.

REFERENČNI PROFIL IZRAŽANJA

Pri določitvi referenčnega profila izražanja, ki pogojuje sprožitev apoptoze, so raziskovalci izbrali kombinacijo markerjev (miRNA) z visokimi in nizkimi ravnmi izražanja v celicah HeLa. Pri tem so pazili, da je izražanje istih miRNA v drugih celicah drugačno.

I. miRNA Z VISOKIMI RAVNMI IZRAŽANJA

V primeru miRNA z visokimi ravnmi izražanji v celicah HeLa so načrtali senzorni motiv, t.i. modul dvojnega obrata (ang. »double-inversion« module), ki dovoljuje izražanje izhodnega signala samo v primeru, da se specifično določena miRNA izraža v zadostni meri.

Modul, ki so ga uporabili pri tej raziskavi, sestoji iz sledečih komponent:

  • gena za reverzni tetraciklinski transaktivator (rtTA)* pod kontrolo citomegalovirusnega (CMV) promotorja.
  • gena za Lac represor (LacI) pod kontrolo pTRE promotorja, ki vsebuje odzivni element za tetraciklin (TRE) in
  • gena za izhodni protein pod kontrolo CAGop promotorja (gre za hibridni promotor, ki vsebuje operatorski mesti LacO v intronu)

Pri rtTA gre za mutirano obliko tetraciklinskega represorja (rTetR), zaradi česar se rtTA obnaša nasprotno kot tetraciklinski transaktivator tTA. Na TRE se rtTA veže samo v prisotnosti tetraciklina (ali analoga doksiciklina), zato tak sistem imenujemo tudi sistem tetraciklin ON.

Gena za rtTA in LacI so načrtali tako, da so v 3' neprevedeno regijo (3'UTR) obeh genov dodali po štiri ponovitve, ki na osnovi komplementarnosti omogočajo vezavo miRNA na mRNA obeh genov.

Delovanje modula je odvisno od ravni izražanja specifično določene miRNA. Nizke ravni ustrezne miRNA: rtTA se konstitutivno izraža in se veže na TRE ob sočasni prisotnosti tetraciklina (oz. njegovega analoga doksiciklina). Na ta način pride do izražanja LacI, ki se veže na operatorski mesti LacO v CAGop promotorju. Izhodni protein se zato ne izraža. Visoke ravni ustrezne miRNA: miRNA se veže na komplementarne ponovitve v mRNA za rtTA in LacI, kar povzroči RNA-interferenco (RNA-i). Ker ne pride do translacije rtTA in LacI, se izhodni protein lahko izraža.

II. miRNA Z NIZKIMI RAVNMI IZRAŽANJA

V tem primeru je senzor enostavnejši. V gen za izhodni protein (isti gen kot pri modulu »dvojnega obrata«) so v 3'UTR dodali po štiri ponovitve, ki predstavljajo komplementarno regijo za vezavo ustrezne miRNA na mRNA izhodnega proteina. Tu gre za miRNA z nizkimi ravnmi izražanja.

NABOR VSEH miRNA

Nabor vseh miRNA (z visokim in nizkim izražanjem) so določili z uporabo matematičnega modela, ki je temeljil na eksperimentalno pridobljenih odzivih v posameznih tipih celic. Ugotovili so, da sta za miRNA z visokimi ravnmi izražanja najprimernejši miR-21 ter kombinacija miR-17 in miR-30a (miR-17-30a). Izražanje omenjenih miRNA je bilo vsaj 5-krat večje v celicah HeLa kot v veliki večini drugih celic.

Za določitev miRNA z nizkimi ravnmi izražanja so poiskali take miRNA, ki se v celicah, ki bi lahko dale lažno pozitivne rezultate, precej izražajo, v celicah HeLa pa ne. Tako so v vezje dodali naslednje miRNA: miR-141, miR-142(3p) in miR-146a.

Celotno vezje lahko tako zapišemo z uporabo parametrov IN-NE kot:

miR-21 IN miR-17-30a

IN NE miR-141

IN NE miR-142(3p)

IN NE miR-146a

VALIDACIJA VEZJA

Pred testiranjem vezja so v celicah HeLa ovrednotili vse možne kombinacije vhodnih signalov miRNA (skupaj 25 = 32). To so naredili tako, da so pripravili različne konstrukte. Da bi ovrednotili stanje, kjer se miR-21 in/ali miR-17-30a nizko izražata, so v ustreznih konstruktih zbrisali ponovitve za vezavo teh miRNA. Visoke ravni izražanja miR-141, miR-142(3p) in miR-146a, ki se v celicah HeLa ne izražajo, so dosegli s transfekcijo celic HeLa z ustrezno kombinacijo teh treh miRNA. Kot izhodni signal so uporabili zapis za rdeč fluorescenčni protein DsRed. S primerjavo ravni izražanja DsRed med različnimi konstrukti so ugotovili, da se vezje ustrezno odziva na vhodne signale. V nekaterih primerih (kjer je bila miR-21 ali miR-17-30a na OFF) je prišlo do puščanja, zato so vezje nekoliko optimizirali. V modul »dvojnega obrata« so dodali zapis za dodatno miRNA (miR-FF4), in sicer tako, da se le-ta izraža skupaj z LacI. S tem so pridobili dodaten nivo regulacije izražanja reporterskega proteina DsRed, razmerje ON-OFF pa so izboljšali za 4- do 10-krat.

TESTIRANJE VEZJA

Celotno vezje so testirali na skupno sedmih različnih celičnih linijah, in sicer na celicah HeLa, DAOY, HEK293, MCF-7, SH-SY5Y, SKBR3 in T47D. Z izjemo celic HEK293 gre za rakave celične linije. Pri testiranju so uporabili vezje z zapisom za DsRed, kasneje pa še enako vezje z zapisom za hBax.

I. DsRed

Pričakovano so ugotovili, da je po transfekciji celic z vezjem izražanje DsRed precej višje v celicah HeLa kot v ostalih celicah (tako glede na absolutno kot relativno vrednost fluorescence). Vrednosti fluorescence DsRed so bile normalizirane glede na različno izražanje le-tega v različnih celicah pod nereprimiranim CAGop promotorjem.

II. hBax

Raziskovalce je zanimalo, ali lahko tako vezje selektivno sproži apoptozo. V vezju so zato gen za DsRed zamenjali z genom za hBax (človeški Bcl-2 protein, povezan z X kromosomom). Protein hBax kot aktivator apoptoze deluje na mitohondrijske anionske kanalčke, in sicer tako, da poveča njihovo odprtje. To vodi v sproščanje citokroma c iz mitohondrija in začetek intrinzične poti apoptoze.

Ker izražanje hBax učinkovito pobije samo celice HeLa in HEK293, so teste sprožitve apoptoze izvajali na teh dveh tipih celic. Celice so kotransfecirali z vezjem z zapisom za hBax (več različnih plazmidov) in plazmidom z zapisom za ciani fluorescenčni protein (AmCyan), ki je služil kot preživetveni reporter. Delež celic, ki so po kotransfekciji preživele, je bil višji pri celicah HEK293, kar kaže na selektivnost vezja pri sprožitvi apoptoze. Uspešnost vezja so testirali tudi v kokulturi celic HeLa in HEK293. Za razlikovanje med celicami so pripravili ustrezne fluorescenčne celice, in sicer HeLa-EYFP (HeLa, ki izražajo rumen fluorescenčni protein) in HEK293-Cerulean (HEK293, ki izražajo ciani fluorescenčni protein), kar je omogočilo kasnejše ločevanje z ločevalnikom fluorescenčno označenih celic (ang. FACS). Celice so kotransfecirali z vezjem z zapisom za hBax (več plazmidov) in plazmidom z zapisom za DsRed, ki je služil kot transfekcijski marker. V celicah HeLa je prišlo do močnejšega izražanja hBax in posledično več apoptoze. To je precej zmanjšalo število celic HeLa, ki so izražale DsRed, v primerjavi s celicami HEK293.

MOŽNOSTI UPORABE VEZJA

Rezultati testiranja omenjenega vezja kažejo, da lahko sinteznobiološki sistemi uspešno zaznavajo stanje v celicah in sprožajo ustrezne celične odzive. Take sisteme bi lahko uporabljali v in vitro aplikacijah, kot je npr. presejanje zdravil. V prihodnosti bi jih lahko izkoristili tudi v terapevtske namene, vendar je predpogoj za to razvoj metod za uspešno in vivo dostavo konstruktov DNA v celice.

VIRI

[1] Z. Xie, L. Wroblewska, L. Prochazka, R. Weiss, Y. Benenson. Multi-input RNAi-based logic circuit for identification of specific cancer cells. Science. 2011, 333, 1307–1311.

[2] Z. Xie, L. Wroblewska, L. Prochazka, R. Weiss, Y. Benenson. Supporting Online Material for: Multi-Input RNAi-Based Logic Circuit for Identification of Specific Cancer Cells.

[3] BAX BCL2 associated X, apoptosis regulator [ Homo sapiens (human) ]. Dostopno na naslovu: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/gene/581.

[4] Tetracycline (Tet) Inducible Expression. Dostopno na naslovu: https://www.addgene.org/tetracycline/.