View source

Sydney Australia [http://2016.igem.org/Team:Sydney_Australia]

== Etilen - signal zrelosti sadja ==

Etilen je plin, ki pri sadju in rastlinah deluje kot hormon, ki pospeši proces njihovega zorenja.  Sinteza etilena poteka v celicah sadja in s sproščanjem v njihovo okolico pospešuje lastno zorenje ter vpliva tudi na sadje v okolici. Etilen učinkuje pri zelo nizkih koncentracijah, saj že koncentracija manjša od 1 ppm sproži proces zorenja pri klimakteričnem sadju in s tem vpliva na njegovo obstojnost.  Na trajnejšo obstojnost dobrin na policah trgovin pa pomembno vplivajo tudi razmere v dobavni verigi hitro pokvarljivih plodov. Prilagojena in kontrolirana atmosfera v prostorih za transport je ključna za ohranitev svežine pokvarljivega tovora, saj lahko z nadzorom pogojev zagotovimo želeno presnovno obnašanje sadja. Zato poznavanje koncentracije etilena v okolici sadja predstavlja zelo dobro oceno stopnje njihove zrelosti in oceno predvidenega roka trajanja. Zaradi učinkovanja etilena pri nizkih koncentracijah pa morajo biti merilne naprave sposobne zagotavljati visoko občutljivost in specifičnost zaznave. V najboljšem primeru pa bi bila hkrati naprava tudi hitro odzivna in na voljo po nizki ceni, vendar do sedaj takšnih naprav ni na voljo.

==Biosenzor etilena==

Da bi rešili problem visokih stroškov in nepraktičnosti merjenja koncentracije etilena je skupina iz Sydneyja na tekmovanju iGEM 2016 predstavila projekt za razvoj poceni biosenzorja za zaznavo etilena. Namen projekta je bil najti ustrezen zaznavni sistem prisoten v naravi in ustvariti odzivno genetsko vezje, ki bi dalo merljiv barven signal v območju vidne svetlobe, kar bi omogočilo merjenje vsakemu uporabniku pametnega telefona. Med drugim je njihovo delo obsegalo identifikacijo zaznavnih regulatornih komponent in optimizacijo obarvanosti reporterskega sistema ter načrtovanje uporabne oblike biosenzorja.

==Zaznavni sistem==

Metabolizem etilena je dokaj dobro poznan pri nekaterih sevih Mycobacterium, ki so sposobne v prisotnosti kisika oksidirati etilen iz okolice. Bakterija Mycobacterium NBB4 je dobro poznan etilen oksidirajoči sev in je skupini služil kot izhodišče pri iskanju ključnih genov v zaznavi in odzivnosti na prisotnost etilena. Pri bakteriji Mycobacterium NBB4 so proteini, ki so potrebni za katabolizem etilena urejeni znotraj operona, ki večinoma vsebuje zapis za encime potrebne za pretvorbo etilena do acetil-CoA. Medtem ko so encimske reakcije dobro poznane pa je regulatorni mehanizem njihovega izražanja nepojasnjen. Raziskave izražanja etilen oksidirajočih encimov so pokazale, da se ti izražajo le takrat, ko so bakterije izpostavljene etilenu, kar kaže na to, da so njihovi geni pod kontrolo inducibilnega promotorja.
 
Ekipa je znotraj genskega klastra izbrala dva gena, za katera so domnevali, da imata regulatorno vlogo. Predvidevali so, da v prisotnosti etilena gen EtnR1 in EtnR2 sodelujeta pri prenosu signala in aktivaciji izražanja genov pod domnevnim promotorjem EtnP.  Za vezavo etilena naj bi bil odgovoren membranski receptor EtnR2, ki ob aktivaciji fosforilira EtnR1, ki deluje kot regulator transkripcije promotorja EtnP. Predvidevali so da je delovanje podobno dvokomponentnemu sistemu pogosto prisotnem pri bakterijah, kjer histidinska proteinska kinaza ob aktivaciji fosforilira nek drug regulatorni protein.
  
===Lastnosti EtnR1, EtnR2 in EtnP ===

Predpostavili so, da proteina EtnR1 in EtnR2 regulirata izražanje proteinov v prisotnosti etilena. Navedli so nekaj razlogov, s katerimi so želeli podkrepili svojo domnevo:

-	funkcija obeh genov je poleg vseh ostalih genov operona najmanj poznana,

-	oba gena sta dobro ohranja med etilen oksidirajočimi sevi Mycobacterium,

-	bakterije pogosto uporabljajo dvokomponentni sistem signaliziranja,

-	EtnR1 ima DNA vezavno domeno in kinazno domeno, EtnR2 ima MEDS domeno za vezavo substrata.

Uspešno so optimizirali rabo kodona obeh proteinov in proteina izrazili v bakteriji ''E. coli'' v vektorju pET28c pod T7 inducibilnim promotorejm. S testom EMSA so preverili interakcije proteina EtnR1 in DNA sekvence domnevnega promotorja EtnP. Ugotovili so, da se EtnR1 uspešno veže na zaporedje EtnP, kar naj bi pomenilo, da deluje kot transkripcijski faktor  v metabolizmu etilena.

==Reporterski sistem==

Kot reporterski protein so se odločili uporabit kromoprotein amilCP z absorbcijskim vrhom pri 588 nm, ki se v naravi nahaja v koralah Acropora millepora in jim daje močno modro barvo, ki je vidna s prostim očesom. Ker je obarvanost proteina v območju vidne svetlobe, je uporabniku omogočena enostavna zaznava signala, ki ga daje biosenzor.  Podlaga za njihovo delo je bila biokocka, ki jo je pred leti na tekmovanju iGEM razvila skupina iz Švedske. Vendar so se jo za potrebe biosenzorja odločili nekoliko izboljšati v vsaj treh lastnostih. Namen je bil pridobiti nove mutante različnih barv, skrajšati odzivni čas razvoja barve in pridobiti intenzivnejšo obarvanje za izboljšanje občutljivosti zaznave.
Odločili so se za uvedbo naključnih mutacij, ker ni bilo poznanih ciljanih mest, ki bi povzročila spremembo barve proteina. Za pridobitev novih mutant so uporabili metodo PCR v prisotnosti Mn2+ ionov, ki pri podvojevanju povzročijo napako polimeraza na naključnih mestih znotraj regije določene z začetnimi oligonukleotidi. Po transformaciji celic so uspešnost mutacij določili s štetjem obarvanih kolonij. Izbrali so posamezne kolonije določene barve in določili njihov zapis in tako ugotovili katere mutacije so povzročile spremembo barve. Za vse barvne mutante je bilo značilno, da so vsebovale le eno točkovno mutacijo. Polovica kolonij pa je bila brezbarvnih, večinoma zaradi zamika bralnega okvirja znotraj kodirajoče regije. 
Uspelo jim je pridobiti tri barvne mutante, ki so se obarvale vijolično roza in zeleno. V primeru vijolične mutante se je barva razvila po prekonočni inkubaciji, medtem ko sta ostali mutanti za razvoj barve potrebovali dva do tri dni.

==Načrtovanje uporabne oblike biosenzorja==

Kot končni konstrukt so predstavili dva plazmidna vektorja, kjer je prvi vseboval zapis za EtnR2 drugi pa zapis za EtnR1 in zapis za amilCP pod promotorjem EtnP. Za ekspresijski sitem v katerega bi vstavili genetsko vezje pa bi uporabili bakterije E. coli.
Osredotočili so se tudi na praktično uporabnost njihovega biosenzorja in preučili možnosti imobilizacije celic na površino, ki bi hkrati zagotavljala odzivnost in biološko varnost. Primerna rešitev se jim je zdel nanos celic na nanopore iz mešanice lateksa in ogljikovih hidratov. Takšen sistem bi omogočil vstop majhnim molekulam, kot je npr.  etilien. Omogočen bi bil tudi vstop hranilnih snovi hkrati pa bi bil pobeg celic v okolje onemogočen. Nanopore iz lateksa bi nanesli v obliki premaz na poceni in razgradljiv meterial. Primeren bi bil papir ali podoben celulozni material, kar bi tudi zelo razširilo možnosti uporabe, saj se lahko enostavno razreže in razpošlje v različnih oblikah. Postopek bi torej vključeval gojenje gensko spremenjenih celic, ki bi jih nato zmešali z raztopino lateksa in nanesli na površino papirja. Ekipa si je kot končno uresničitev ideje zamislila samolepilne lističe, ki bi jih pritrdili na površino sadja. Razvijali pa so tudi aplikacijo, ki bi analizirala obarvanost lističev in na ta način potrošnikom in trgovcem omogočila enostavno določitev zrelosti sadja.

==Vpliv nove tehnologije na okolje==
Predviden vpliv, ki ga bo imela ta tehnologija na procese in okolje ni velik. Največji možni pričakovani vpliv bi bila izguba nekaj delovnih mest. Trenutno je ročno testiranje najboljši način s katerim industrija preverja kakovost in zrelost produktov. Možnost uporabe senzorjev koncentracije etilena, kot indikatorja zrelosti sadja, bi močno zmanjšala vložek zahtevanega dela. Cenejša, hitrejša in natančnejša metoda določanja zrelosti sadja bi vplivala na povečan izvoz in uvoz produktov, saj se bi tveganje za pokvarljivost močno zmanjšalo. 
Ko bo enkrat merjenje etilena optimizirano na enostavno, natančno in praktično uporabno metodo, bo postala manipulacija koncentracije etilena tudi bolj razširjena. Enostaven merilni sistem bo omogočil natančnejšo in dinamično manipulacijo etilena, kar bo privedlo do manj zavržene hrane med transportom, predvsem v primeru hitro pokvarljivih produktov. Pokvarljivost namreč povzroči zavrženje tudi do 50 % svežega sadja. Možnost poceni in enostavnega merjenja etilena pa bi proizvajalcem, trgovcem in potrošnikom lahko pomagala znatno znižati delež zavrženega sadja in zelenjave.

==Viri==

- http://2016.igem.org/Team:Sydney_Australia

- Coleman, N. V., Yau, S., Wilson, N. L., Nolan, L. M., Migocki, M. D., Ly, M., Crossett, B. and Holmes, A. J. (2011). Untangling the multiple monooxygenases of Mycobacterium chubuense strain NBB4, a versatile hydrocarbon degrader. Environmental Microbiology Reports, 3(3), pp.297-307.