View source for Biotic Blue - encimska razgradnja zdravilnih učinkovin v odpadnih vodah

Povzeto po iGEM projektu 2018 študentske ekipe iz Stockholma http://2018.igem.org/Team:Stockholm, katere glavni namen je bil razviti novo rešitev za razgradnjo zdravilnih učinkovin v odpadnih vodah – Biotic Blue. Ekipa je prejela nagrado za najboljši okoljski projekt. 

Avtorica povzetka: Tina Požun 

==  OZADJE IDEJE  == 
Voda je za ohranjanje življenja, kot ga poznamo, nepogrešljiva. V zadnjih desetletjih smo priča alarmni stopnji poslabšanja kakovosti vode, za kar je med drugim kriva široka uporaba zdravil. Eden večjih onesnaževalcev vodnih virov so farmacevtske aktivne učinkovine kot so antibiotiki. Ker jih običajni procesi čiščenja odpadnih vod ne morejo učinkovito odstranjevati, je bil glavni namen ekipe, ustvariti orodje za razgradnjo najpogosteje prisotnega antibiotika v Baltskem morju – sulfametoksazola. S pomočjo metod sintezne biologije so ustvarili Biotic Blue, rešitev, ki temelji na encimski razgradnji antibiotika v čistilnih napravah. 

=== Sulfametoksazol ===
Sulfametoksazol (SMX) je bakteriostatični sulfonamidni antibiotik, ki se uporablja za zdravljenje okužb sečil, dihal in prebavil pa tudi za zdravljenje malarije ter konjunktivitisa <ref> Masters P. A., O'Bryan T. A., Zurlo J., 2003. Trimethoprim-Sulfamethoxazole Revisited. ''Archives of Internal Medicines''. 163(4), 402-410</ref>. V odpadnih vodah, blatu, podtalnici, površinski vodi in v morski bioti Baltskega morja so bile odkrite zaskrbljujoče koncentracije antibiotika. Njegova bioakumulacija povzroča cvetenje alg, moti dušikov cikel, povzroča spremembe v mikrobnih skupnostih in prispeva k razvoju odpornosti bakterij na antibiotike <ref>Zandaryaa S., 2017. Pharmaceuticals in the aquatic environment of the Baltic Sea region (A status report). V: Zandaryaa S.ur., Pyhala M.ur., ''Emerging Pollutants in Water Series''. Paris: UNESCO, HELCOM. http://www.helcom.fi/Lists/Publications/BSEP149.pdf [16. 12. 2018]</ref>. 

=== Lakaza ===
Lakaze spadajo v družino multibakrovih oksidaz z visokim redoks potencialom. Oksidirajo različne substrate preko štirih elektronskih redukcij O<sub>2</sub> v H<sub>2</sub>O, zaradi česar so pomembne za bioremediacijo in uporabne v številnih biotehnoloških procesih. Lakaze imajo relativno nizko substratno specifičnost, zaradi česar oksidirajo širok nabor aromatskih spojin, med drugim tudi SMX in druge farmacevtske učinkovine <ref>Jones S. M., Solomon E. I., 2015. Electron Transfer and Reaction Mechanism of Laccases. ''Cellular and Mollecular Life Sciences''. 72(5), 869–883</ref>,<ref>Alcalde M., 2007. Laccases: Biological functions, molecular structure and industrial applications. V: Polaina J. ur., MacCabe A.P. ur. ''Industrial Enzymes: Structure, Function and Applications.'' Dordrecht: Springer. 461-476
</ref>. Vir oksidoreduktaze pri Biotic Blue je bila lakaza z znano kristalno strukturo iz lesne glive ''Trametes versicolor'' <ref>Protein Data Bank. [Internetni vir]. Prosto dostopno na: https://www.rcsb.org/structure/1gyc [16. 12. 2018]
</ref>.

== BIOTIC BLUE  == 
=== Racionalno načrtovanje encima ===
Lakaza zaradi nizke aktivnosti in posledične počasne razgradnje substratov ni najbolj primerna za učinkovito čiščenje odpadnih vod. Da bi povečali njeno specifičnost in aktivnost za razgradnjo SMX, so se študentje odločili, da bodo s pomočjo racionalnega načrtovanja poskusili pripraviti izboljšano lakazo. Najprej so želeli razumeti njeno delovanje (na kakšen način interagira s substratom) ter nato preučili, kako bi na njeno aktivnost vplivala uvedba določenih mutacij. Poiskali so najboljše mutacije, jih nato natančno ''in silico'' uvedli v aktivno mesto encima ter teoretične podatke primerjali z eksperimentalnimi v laboratoriju. Te so ponovno računalniško obdelali in tako izboljšali model, kar je vodilo v neprekinjen cikel »Design-Build-Test«. Na koncu so izbrali najboljši model in mutirano lakazo pripravili v laboratoriju. Uporabili so tri metode molekularnega modeliranja. S pomočjo računalniških programov kvantne mehanike (QM) so okarakterizirali potek reakcije, za analizo interakcij med encimom in substratom so uporabili programe kvantne mehanike skupaj s programi molekularne mehanike (QM/MM), samo strukturo encima pa so zanalizirali s pomočjo programov molekularne dinamike (MD). Vse izračune jim je omogočila uporaba superračunalnika Kebnekaise <ref>Spletna stran HPC2N. [Internetni vir]. Prosto dostopno na: https://www.hpc2n.umu.se/resources/hardware/kebnekaise [16. 12. 2018]</ref>.

=== Proizvodnja platforma  ===
Cilj te stopnje je bil proizvesti in očistiti mutirano in nemutriano lakazo. 

==== Proizvodnja encima ==== 
Z modificiranjem dostopnega BioBricka <ref>iGEM Registry of Standard Biological Parts.(22. 10. 2010)[Internetni vir]. Prosto dostopno na: http://parts.igem.org/Part:BBa_K500002 [16. 12. 2018]</ref> so pripravili nemutirano lakazo. Biokocko so modificirali z reakcijo PCR, v kateri so prek previsnih koncev dodali restrikcijska mesta za kloniranje v vektor pPICZα A. Dodali so tudi dvojni stop kodon, na N-konec oznako 6xHis-Tag in odstranili prvotno signalno sekvenco. Tako so ustvarili fuzijski protein s sekrecijskim signalom a-faktor iz ''S.cerevisiae'', ki se nahaja na vektorju in je pod nadzorom inducibilnega promotorja AOX1 pod kontrolo metanola. Za pomnoževanje so uporabili ''E.Coli'' TOP10, in naredili selekcijo na gojišču z zeocinom. V register so zapis za nemutirano lakazo vnesli kot novo biokocko BBa_K2835003 <ref>iGEM Registry of Standard Biological Parts. (11. 9. 2018)[Internetni vir]. Prosto dostopno na: http://parts.igem.org/wiki/index.php/Part:BBa_K2835003 [16. 12. 2018]</ref>, na osnovi katere je temeljila sekvenca za mutirano lakazo. Glede na najboljše rezultate racionalnega načrtovanja so fenilalanin (Phe) na mestu 162 zamenjali z levcinom (Leu), fenilalanin (Phe) na mestih 332 in 337 pa z izolevcinom (Ile). Kodonsko optimizirano zaporedje so naročili pri podjetju Integrated DNA Technologies (IDT) in mutirano lakazo v register vnesli kot BBa_K2835004 <ref>iGEM Registry of Standard Biological Parts. (15. 9. 2018)[Internetni vir]. Prosto dostopno na: http://parts.igem.org/Part:BBa_K2835004 [16. 12. 2018]</ref>.
Za izražanje obeh encimov so potrebovali evkariontski ekspresijski sistem, saj se mora lakaza za pravilno zvitje in aktivnost ustrezno post-translacijsko modificirati. Izbrali so sev ''Pichie pastoris'' X33, ki ima večje izkoristke pri izražanju in omogoča lažje čiščenje v primerjavi s S. cerevisiae. Kvasovke so transformirali z elektroporacijo in uspešnost transformacije potrdili z metodo PCR na osnovi kolonije. 
Celice so najprej en dan gojili v mediju BMGY z glicerolom, ki je derepresiral z glukozo represiran promotor AOX1. Klone so nato pregledali in jih nadaljnjih pet dni gojili v mediju BMMY z 1-kratnim metanolom in 0,2 mM CuSO<sub>4</sub>. Dodatek metanola je sprožil transkripcijo lakaze, CuSO<sub>4</sub> pa je bil nujno potreben za pravilno zvitje lakaze. Vzorce so med gojenjem v mediju BMMY dnevno analizirali in njihovo encimsko aktivnost testirali s substratom ABTS. 
Mutirana lakaza se ni uspešno izrazila, čeprav so z metodo PCR na osnovi kolonije pokazali, da se je zapis zanjo integriral v genom kvasovke. Tudi na gelu ni bilo lise pričakovane velikosti. Opazili so, da se je mutirana lakaza zvila drugače kot nemutirana in po ponovno zagnani simulaciji ugotovili, da so zamenjane, manjše aminokisline tvorile napetost v proteinskem ogrodju in tako encim silile v razvito strukturo. 
 
==== Čiščenje encima ==== 
Za čiščenje encima so uporabili imobilizirano kovinsko afinitetno kromatografijo (IMAC) in frakcijo preverili z NaDS-PAGE. Encim so še dodatno očistili z velikostno-izključitveno kromatografijo (SEC) in MALDI-TOF masno spektrometrijo.

==== Usmerjena mutageneza ==== 
Za hitrejše uvajanje mutacij so raziskali in preskusili usmerjeno mutagenezno tehniko SAMURAI. Slednja omogoča enostavno uvajanje različnih usmerjenih mutacij, ki jih predlaga predhodno modeliranje. Metoda je hitra in enostavna, uporabniku pa omogoča uvedbo številnih mutacij v istem genu v le enem eksperimentu in to z visoko čistostjo končnega produkta <ref> iGEM Stockholm 2018 Project - BioBrick Improvement. [Internetni vir]. Prosto dostopno na: http://2018.igem.org/Team:Stockholm/Improve [16. 12. 2018] </ref>.

=== Kontrola kakovosti === 
Ker se mutirana lakaza ni uspešno izrazila, so kontrolo kakovosti s testi encimske aktivnosti, specifične aktivnosti in ekotoksičnosti izvedli s komercialno in nemutirano lakazo. 

==== Testiranje encimske aktivnosti ==== 
Najprej so določili optimalne pogoje delovanja encima. Lakaza je največjo aktivnost izkazovala pri temperaturi 40 °C in pH=4, kar kaže na to, da ima v splošnem raje kislo okolje. 
Ker se ocena aktivnosti lakaze spektrofotometrično ne more merit s sulfametoksazolom, zaradi prepočasne reakcije z lakazo, so zato uporabili modelni substrat ABTS. Lakaza oksidira substrat ABTS v bolj stabilno stanje kationskega radikala, ki je intenzivno modrozeleno obarvan in močno absorbira pri valovni dolžini 420 nm.
Za primerjavo aktivnosti encimov so določili Michaelisovo konstanto K<sub>M</sub>, ki določa afiniteto encima za substrat, in pretvorbeno število k<sub>cat</sub>, ki nam pove, koliko substrata na sekundo lahko encim razgradi. Pretvorbeno število k<sub>cat</sub>=4,2 s<sup>-1</sup> za nemutirano lakazo so izračunali iz eksperimentalno dobljenih podatkov po modelu Michaelis-Mentenove. Kljub temu, da encimske aktivnosti za mutirano lakazo niso mogli izmeriti, so jo teoretično izračunali na podlagi kvantno-mehanskih modelov molekulskega načrtovanja. Za nekaj različnih konformacij so ugotovili, da bi bil njen izračunan kcat za SMX približno konstanten in 300-krat večji.

==== Testiranje razgradnje SMX ====
Test razgradnje primerja učinkovitost remediacijskega procesa komercialne lakaze pri optimalnih pogojih. Za oceno sposobnosti razgradnje SMX-a so uporabili reverzno fazno visoko zmogljivo tekočinsko kromatografijo (HPLC), s katero so analizirali koncentracijo antibiotika po različnih časih inkubacije z lakazo v delno zaprtih vialah, pri čemer je bil njihov rezultat pomanjkljiv. 

==== Testiranje ekotoksičnosti razgradnje SMX ====
Da bi se prepričali, da se z encimsko razgradnjo antibiotika ne generirajo še bolj ekotoksični razgradni produkti, so naredili dva testa. Najprej so izvedli test inhibicije rasti, kjer so s kombinacijo lakaza-SMX tretirali ''E. Coli'' in dokazali, da transformacijski produkti v primerjavi s čistim SMX manj inhibirajo rast bakterij. Nato so izvedli še bioluminiscenčni test z ''A. fischeri'', kjer so merili inhibicijo svetlobe, ki korelira s smrtnostjo ''A. fischeri''. Reakcijo so izvedli pri dveh različnih koncentracijah antibiotika in glede na razlike v bioluminiscenci določili EC<sub>50</sub> ter dokazali manjšo ekotoksično moč razgradnih produktov. 

=== Imobilizacija ===
Za pripravo encima, primernega za uporabo v čistilnih napravah, so morali lakazo imobilizirati. Misel o uporabi EnginZyme imobilizacijskega sistema so zaradi omejitev opustili in se odločili za imobilizacijo encima na magnetitnih kroglicah. Te so najprej prevlekli s plastjo polistiren sulfonata, nato pa še s plastjo hitosana, na katerega so vezali še glutaraldehid, ki premreži encime ter jih na ta način imobilizira. Ker tako imobilizirana lakaza ni bila aktivna, so uporabili s streptavidinom prevlečene supermagnetne kroglice Dynabeads®, na katere se veže biotinilirana lakaza. Slednji princip je hitrejši, enostavnejši, lakaza pa je bila dokazano aktivna.

==  UPORABA ==
Biotic Blue je brezcelični sistem, gre le za encim, imobiliziran na magnetnih kroglicah. Namenjen je uporabi v čistilnih napravah kot dodatna faza čiščenja pred biološko stopnjo. Zasnovan je tako, da je kompatibilen z že obstoječo opremo v čistilnih napravah in bi za samo izvedbo potrebovali le dodaten rezervoar za vodo, magnet, prezračevalni sistem, zbiralno komoro, kamor bi pritekal svež pufer za regeneracijo encima, in črpalko, ki bi dovajala sveže kroglice z encimom v začetni rezervoar z vodo. Sistem je zaprt in modularen, tako da lahko deluje popolnoma avtomatsko.  

==  ZAKLJUČEK ==
Za razgradnjo zdravilnih učinkovin v odpadnih vodah je razvitih nekaj tehnologij, ki imajo določene omejitve, zaradi katerih je njihova širša uporaba v čistilnih napravah omejena<ref>Wang J., Wang S., 2016. Removal of pharmaceuticals and personal care products (PPCPs) from Wastewater. ''Journal of Environmental Management''. 182, 620-640</ref>. Imobilizacija lakaze in pametna uporaba magneta omogočata, da je rešitev Biotic Blue učinkovita in cenovno ugodna, ima manjšo porabo energije in je prijazna tako okolju kot ljudem. Poleg tega pa povečuje samo varnost ponovne uporabe odpadnih vod, zmanjšuje onesnaževanje z zdravili ter tako ščiti in obnavlja vodne ekosisteme.

----
<references/>