View source

(Neža Gaube)
==Uvod==
Rezistenca na antibiotike postaja zelo velik problem. Zaradi prevelike, napačne in nepotrebne uporabe antibiotikov, se je razvilo že kar nekaj odpornih sevov patogenov (npr. MRSA). Veliko statističnih analiz kaže, da se približno polovica antibiotikov predpiše nepotrebno, saj gre pogosto tudi za virusne okužbe.
Razvoj različnih zelo specifičnih metod (npr. PCR, FISH in ELISA) daje nove možnosti tudi za uporabo sintezne biologije pri ustvarjanju novih in bolj točnih diagnostičnih testov. Trenutne diagnostične metode uporabljajo drago opremo in izobraženo osebje, kar omeji uporabo teh metod. V zadnjem času so na področju detekcije šli v t.i. »"point of care testing"« (POCT), kjer gre za testiranje ob pacientu. Uporablja se različne cenovno ugodne platforme (npr. papirnati trakovi). Tudi pri tem projektu so želeli razviti metodo detekcije na ta način.
Ekipa Munich iz iGEM 2017 si je zamislila, da bi uporabila torej POC test z napravo za in vitro diagnostiko, ker naj bi po njihovi hipotezi bila zmožna ločiti med patogeni (tako virusnimi kot tudi bakterijskimi). Z uporabo take metode bi preprečili oz. zmanjšali neustrezno rabo antibiotikov ter s tem tudi zmanjšali možnost nadaljnje rezistence.
Njihov sistem naj bi vseboval »vse v enem«: priprava vzorca, pomnožitev nukleinskih kislin in detekcija tarče.

==Cas13a==
Uporabili so lastnosti nedavno odkritega efektorjega sistema CRISPR/Cas – Cas13a. Ta se razlikuje od ostalih Cas proteinov s tem, da cepi specifično RNA tarče in ne DNA. ). Njegova struktura ni podobna ostalim »običajnim« Cas encimom (npr. Cas9), ampak ima dve HEPN domeni (Cas9 ima HNH in RuvC domeni za cepitev DNA). Cas13a lahko prepozna katero koli zaporedje RNA in se nanj veže. Nima pa sposobnosti, da bi cepil tarčno RNA, ampak ob vezavi pride do konformacijskih sprememb in se odpre HEPN aktivacijsko mesto s katerim potem nespecifično cepi druge RNA.

Lahko se jo prilagodi na katerokoli zaporedje, kar omogoča, da se napravo naredi specifično za kateri koli patogen. Je tudi zelo specifična in občutljiva, saj zazna tarčno zaporedje tudi če je prisotno le v sledeh. Za delovanje pa Cas13a potrebuje crRNA. iGEM ekipa je pripravila programsko opremo (software) s pomočjo katere lahko lažje pripravimo ustrezno crRNA. Lahko si pa tudi pomagamo s podatkovno bazo z že uporabljenimi crRNA, ki so jo prav tako pripravili v okviru projekta.


==Projekt==
Projekt je bil sestavljen iz treh modulov. <br>
1)	Modul priprave vzorca (liza izbranih patogenov in pomnožitev tarčnih sekvenc dokler ne dosežemo količine RNA, ki jo lahko zaznamo s Cas13a) <br>
2)	Modul čiščenja in karakterizacije Cas13a  (priprava Cas13a za diagnostiko)<br>
3)	Modul detekcije (naredi signal viden uporabniku)<br>
Vse tri module so sestavili v prenosno obliko (primeren hardware). Posamezne module so razvijali neodvisno drug od drugega.

===1.Modul: Priprava vzorca:===
Cilj je bil torej pridobiti količino tarčne RNA, ki jo lahko zaznamo iz vzorca celic "E. coli", ki so si jo izbrali za izvedbo poskusa. Najprej so primerjali različne tehnike lize celic. Učinkovitost so preverili z agarozno gelsko elektroforezo.<br>
Uporabili so:<br>
-	Liza s kaotropnimi snovmi (na koncu lize je potrebno čiščenje lizata, ki vsebuje toksične kemikalije)<br>
-	Inkubacija pri visoki temperaturi z detergenti npr. NaDS (dobili so dobre rezultate, ampak je vseeno potrebna ločitev NaDS od tarčne RNA)<br>
-	Liza s toploto (dodatno čiščenje ni potrebno)<br>
Vzorec so čistili z različnimi postopki s silikagelom, a so na koncu vseeno izbrali metodo, kjer dodatno čiščenje ni potrebno. Uporabili so lizo s toploto, ki ji sledi pomnožitev z rekombinazo in polimerazo (RPA). To je izotermna alternativa PCR. Izvaja se pri 37 °C brez potrebe, da bi menjavali temperature, zaradi česar je cenejša metoda. <br>
====Potek RPA====
Kompleks rekombinaze in začetnega oligonukleotida najprej »najde« mesto na DNA, ki je homologno začetnemu oligonukleotidu. Potem rekombinaza razpre vijačnico pri čemer pride do hibridizacije med začetnim oligonukleotidom in homolognim mestom na DNA. Na tem mestu se vežejo na drugo verigo dna enoverižni vezavni proteini (SSB). Začetni oligonukleotid se podaljša s pomočjo polimeraze pri čemer se ena veriga odstrani. Na novo sintentiziran dvoverižni kompleks pa se uporabi naprej za nadaljnjo pomnoževanje (postopek se ponavlja). RPA je hitra in občutljiva metoda, ampak pogosto problem predstavlja ozadje.<br>
Tarča proteina Cas13a je RNA in ne DNA, zato so sklopili to RPA še z in vitro transkripcijo, ki poteka prav tako pri 37 °C, zato so lahko dodali reagente za transkripcijo kar v to mešanico brez vmesnega čiščenja.


===2. Modul: Čiščenje in karakterizacija Cas13a===
====Čiščenje====
Pripravili so nove biokocke za ekspresijo in čiščenje proteina Cas13a.<br>
Priprava:<br>
Analizirali so proteine iz družine Cas13a iz družin različnih organizmov.  "Leptotrichia buccalis" (Lbu), "Leptotrichia shahii" (Lsh) in "Leptotrichia wadei" (Lwa). Naročili so plazmida za Lbu in Lsh ter protein izrazili v "E.coli Rosetta2". Za Lwa pa so sami pripravili plazmid in ga izrazili v "E.coli BL21". Njihov konstrukt je bil sestavljen iz T7 promotorja, His oznake, SUMO oznake, zaporedja proteina in terminatorja. Naredili so fuzijo z majhnim ubikvintinu podobnim proteinom (SUMO), da so povečali topnost Cas13a proteina.
Izolirani protein so očistili z Ni-NTA agarozo. His-SUMO oznaki so cepili s proteazo ter nato še enkrat uporabili Ni-NTA, da so odstranili tiste proteine pri katerih se His oznaka ni odcepila. Na koncu so uporabili še kromatografijo z ločevanjem po velikosti. Čistost dobljenega proteina so preverili še z NaDS-PAGE.
Kljub temu, da so sledili protokolom čiščenja iz literature, le-to ni najbolje uspelo. Ugotovili so, da je čiščenje s His oznako delovalo v redu, kar pomeni, da je bil problem kationsko izmenjevalna kromatografija. Tam so izgubili veliko proteinov. Delo so nadaljevali z nepopolnoma očiščenimi proteini (na sliki poliakrilamidnega gela je poleg lise proteina prisotnih še veliko drugih, kar kaže na precej nečistot). 
Vzporedno so delali s proteini Cas13a iz treh različnih organizmov. Zgoraj je opisan le postopek za Lwa, kjer so sami pripravljali tudi konstrukt.
====Karakterizacija====
Dobljeni Cas13a so karakterizirali z RNaseAlert testom. 

CascAID uporablja torej nespecifično RNazno aktivnost Cas13a, da dobi ojačan signal. V tem modulu so poskrbeli, da pri cepitvi RNA dobijo signal, ki ga je lahko in zanesljivo meriti ter ga uporabnik lahko tudi sam interpretira. Menijo, da je to ključna stopnja projekta, zato so poskusili več možnosti. Test RNaseAlert, test s špinačnim aptamerom, sistem intein-ekstein in druge. Najboljše se je obnesel test RNase Alert, ki je spodaj tudi opisan.
Test RNaseAlert je komercialno dostopni test, ki daje fluorescentni signal s katerim lahko spremljamo aktivnost RNAze. Mešanici tarčne RNA, Cas13a in crRNA so dodali še RNA na katero sta s pomočjo linkerja vezana fluorofor in dušilec (eden na N-konec in drugi na C-konec). Ko pride do cepitve z RNazo, se fluorofor oddalji od dušilca in zato lahko fluorescira. Ker pride do nespecifične RNAzne aktivnosti, je sam signal precej ojačan.
=====Funkcionalnost:=====
Funkcionalnost Cas13 so preverili z uporabo zaporedja 16S rRNA iz E.coli kot tarčno zaporedje. In vitro so prepisali 130 nukleotidov (od 1500). Na podlagi DNA matrice so zasnovali crRNA. Ugotovili so, da sta funkcionalni tako Lbu kot Lwa. Lbu je bil bolj aktiven kot Lwa, kar je v nasprotju s podatki iz literature (Gootenberg in sodelavci, 2017). Pri Lsh pa niso dobili nobenih rezultatov. Nadaljnje poskuse so na podlagi teh podatkov izvajali z Lbu.
=====Specifičnost aktivnosti:=====
Specifičnost aktivnosti Cas13a so preverjali z uporabo različnih tarčnih zaporedij (za "Noro virus", "Hepatitis C" (HCV) in "Bacillus subtilis").
Določili so fluorescenco pri vzorcih posameznih bakterij/virusov, kjer je bila dodana ustrezna crRNA. Te vrednosti so primerjali samo z določitvijo fluorescenve v vzorcu, kjer ni bilo prisotne ustrezne crRNA.
Ker se zavedajo, da je možnost kontaminacije velika, so naredili še en poskus. Izbrali so crRNA Norovirusa in dodali posebej 30 nM koncentracije treh različnih organizmov ("Norovirus", "E. coli" in "HCV"). Ugotovili so, da je prišlo do velikega povečanja fluorescence le v primeru, ko je bil v vzorcu Norovirus. Pri ostalih organizmih do pretiranega povečanja fluorescence ni prišlo. Na podlagi teh podatkov lahko sklepamo, da je ta mehanizem zelo specifičen.
===3. Modul: Detektor===
Za zaznavanje signala so pa potrebovali cenovno ugoden, prenosljiv in dovolj zanesljiv fluorescentni detektor. S pomočjo modeliranja so si ga zamislili ter nato tudi sestavili. Detektor he narejen na osnovi papirja in lahko zazna fluorescin že v koncentracijah do 10 nM. Njegova cena je manj kot 15 dolarjev.

==Zaključek==
CascAID+ predstavlja prenosen, cenovno dostopen in uporaben POC test z dobro občutljivostjo. Prednost CascAID je to, da se ga lahko hitro prilagodi na zelo različne tarče (bakterijske infekcije, hitro razvijujoče se virusne epidemije, z rakom povezane okužbe …). CascAID bi lahko uporabljal zdravnik ali pacient brez dodatnega »potovanja« vzorca do laboratorija. Sama analiza traja približno 30 minut in da dovolj točne informacije, da bi lahko (med drugim) tudi pripomogel k zmanjšanju rezistence bakterij na antibiotike, kar je bil povod za samo izdelavo CascAID sistema.
==Literatura==
1. [http://2017.igem.org/Team:Munich Projekt iGEM 2017, ekipa Munich]<br>
2. Liu L, Li X, Ma J, Li Z, You L, Wang J, Wang M, Zhang X, Wang Y. The molecular architecture for RNA-guided RNA cleavage by Cas13a. Cell. 2017 Aug 10;170(4):714-26. <br>
3. Piepenburg O, Williams CH, Stemple DL, Armes NA. DNA detection using recombination proteins. PLoS biology. 2006 Jun 13;4(7):e204.<br>
4. Abudayyeh OO, Gootenberg JS, Konermann S, Joung J, Slaymaker IM, Cox DB, Shmakov S, Makarova KS, Semenova E, Minakhin L, Severinov K. C2c2 is a single-component programmable RNA-guided RNA-targeting CRISPR effector. Science. 2016 Aug 5;353(6299):aaf5573.<br>