View source for Celulolitični encimi talne glive Penicillium sp. TG2 in njihov potencial pri proizvodnji etanola.

(Članek: Ree Y, Min J, Heo S, et al. Cellulolytic enzymes produced by a newly isolated soil fungus ''Penicillium'' sp . TG2 with potential for use in cellulosic ethanol production. Renew Energy. 2015;76:66-71) 

== UVOD ==
Iskanje novih virov celulolitičnih encimov, ki bi bili sposobni razgradnje različnih celuloznih materialov postaja vedno bolj pomembno. Uporaba sladkornega trsa, škrobnatih rastlin in rastlinskih olj je manj primerna, saj s tem porabljamo vire prehrane, zato bi bilo smiselno najti čim več virov biomase, ki niso hranljivi za človeka. Eden takšnih virov so šopi praznih palmovih plodov (ang. EFB – empty palm fruit bunches). To so lahko dostopni stranski produkti oljne industrije, ki so sestavljeni iz 39,5 % celuloze, 17,3 % hemiceluloze, 28,8 % lignina, 10,3 % ekstraktov in 3,8 % pepela. Slabost lignocelulozne biomase je, da so v nasprotju s škrobnatimi in sladkornimi viri biomase potrebni bolj zapleteni fizikalni, kemijski in biološki procesi za njegovo pripravo. Za encimsko katalizirano razgradnjo celuloznih materialov do fermentabilnih sladkorjev so najprimernejši celulolitični encimi. To so encimi, ki povzročajo hidrolizo celuloze oziroma saharifikacijo in jih skupno imenujemo celulaze. Med njih spadajo endoglukanaza, ki cepi β-1,4 vezi znotraj celuloznih polimerov, eksoglukanaza, ki cepi verige celuloze iz nereducirajočega konca in β-glukozidaza oziroma celobiaza, ki odceplja glukozo, celobiozo in celotriozo (sladkorje, sestavljene iz dveh oziroma treh glukoz) z nereducirajočega konca predhodno načete verige. Med celulaze uvrščamo še celobiohidrolazo, ki pa je v članku ne omenjajo. Da je biološka razgradnja učinkovitejša, biomaso predhodno delno razgradijo z natrijevim hidroksidom pri povišani temperaturi. 
V članku opisujejo najdbo novega glivnega seva, ki so ga poimenovali ''Penicillium'' sp. TG2 in lastnosti celulolitičnih encimov, ki ga le-ta proizvaja.

== MATERIALI IN METODE ==
Na novo izoliran sev ''Penicillium'' sp. TG2 so v članku primerjali z glivo ''Trichoderma reesei'' RUT-C30, ki je znan vir celulolitičnih encimov. Za fermentacijo v etanol so izbrali kvasovko ''Kluyveromyces marxianus'' CBS1555.
Za ugotavljanje splošne celulazne aktivnosti so celice ''Penicillium'' sp. TG2 in ''T. reesei'' RUT-C30 najprej gojili na trdnem gojišču z 0,2 % deležem celuloznega materiala, ki je deloval kot substrat, nato pa so uporabili Gramovo jodno raztopino in merili razgrajeno površino. Iz te so nato določili delež razgrajenega območja tako da so premer razgrajenega območja delili s premerom kolonije (večji delež pomeni boljše delovanje encimov).
Nato so pri obeh glivnih sevih po gojenju izolirali izločene zunajcelične encime in jih testirali glede na njihovo celulazno aktivnost. Pri tem so uporabili metodi DNS in pNPG. 
Pri določevanju endoglukanazne aktivnosti so uporabili metodo DNS. Kot substrat so uporabili karboksimetil celulozno natrijevo sol (CMC) in ji dodali encimsko raztopino, razredčeno s pufrom. Po 30 minutah so dodali 3, 5-dinitrosalicilno kislino (DNS), ki se v prisotnosti reducirajočih sladkorjev pretvori v 3-amino-5-nitrosalicilno kislino. To so lahko zaznali z merjenjem emitirane svetlobe pri 540 nm. 
Eksoglukanazno aktivnost so prav tako določevali z metodo DNS, le da so pri tem uporabili celulozni substrat Avicel.
β-glukanazno aktivnost so določevali s substratom pNPG (p-nitrofenil-β-D-glukopiranozid), ki so mu dodali encimsko raztopino s pufrom. Po inkubaciji in dodatku raztopine Na2CO3 se je odcepil p-nitrofenol in raztopina se je obarvala rdeče. Cepitev so zaznali z merjenjem absorbance pri 405 nm. Celotno koncentracijo proteinov so merili z Bradfordovo metodo, kjer so kot standard uporabili goveji serumski albumin (BSA).
Pri vseh testih je ena enota encimske aktivnosti (1 U) definirana kot količina encima, ki je potreben, da proizvede oziroma sprosti 1 µmol reducirajočega sladkorja/glukoze/p-nitrofenola na minuto pod pogoji encimskega testa.
Na koncu so določili še FPazno (»filter-papirno«) aktivnost teh encimov z uporabo metode DNS in filter papirjem kot substratom. Ena internacionalna enota FPazne aktivnosti je količina encima, ki sprosti 1 µmol glukoze ali drugih reducirajočih sladkorjev na minuto med hidrolizno reakcijo.
Pred saharifikacijo so šope praznih palmovih plodov (EFB) obdelali z 1 M NaOH pri 121 °C za 15 minut. Bazo so sprali z vodo in biomaso posušili. Nato so takšne EFB izpostavili celulaznim encimom in količine sproščenih sladkorjev, ki so jih pridobili z encimsko saharifikacijo, izmerili s tekočinsko kromatografijo (HPLC). Izvedli so še hkratno saharifikacijo in fermentacijo EFB tako, da so encimom dodali celice ''K. marxianus''.

== REZULTATI IN DISKUSIJA ==
S presejalnimi testi (rast celic na trdnem gojišču s celuloznim materialom kot virom ogljika) so našli glivni sev, ki je imel 2-krat višjo endoglukanazno, 1,7-krat višjo eksoglukanazno in 4-krat višjo β-glukozidazno aktivnost kot referenčni sev ''T. reesei'' RUT-C30. Določili so optimalni pH vseh encimov (pH 5) in optimalno temperaturo delovanja (50 °C), pri katerih so dokazali visoko stopnjo hidrolize EFB. Hkratna saharifikacija in fermentacija EFB v etanol ni uspela, saj je imel prvi korak znatno slabši izkoristek. V članku sklepajo, da se je to zgodilo zaradi prisotnosti lignina v industrijskem celuloznem materialu in da je komercialni sev imel boljše izkoristke zaradi dodatka aditivov (npr. hidrofobina).
Celulolitični encimi novoodkritega seva ''Penicillium'' sp. TG2 imajo v primerjavi s komercialnim sevom ''T. reesei'' RUT-C30  podobno aktivnost na lignoceluloznem materialu, zato imajo potencial. Sev bi lahko izboljšali za izdelavo komercialne mešanice celulolitičnih encimov.