View source

[https://academic.oup.com/nar/article/37/2/e16/2410275'''DNA assembler, an ''in vivo'' genetic method for rapid construction of biochemical pathways ''']

(Anja Tanšek)

==Uvod==
Z metodo DNA združevanja (''angl. DNA assembler'') je možno združiti fragmente rekombinantne DNA, tako da sestavimo celotno funkcionalno biokemijsko pot, v enem koraku z izkoriščanjem in vivo homologne rekombinacije v kvasovki Saccharomyces cerevisiae.

Metodo so uspešno uporabili pri pripravi biokemijske sintezne poti D-ksiloze, ki jo sestavljajo 3 geni, kar predstavlja približno 9 kb DNA, in biosintezne poti zeaksantina, za katero je potrebnih 5 genov, kar predstavlja približno 11 kb DNA. Prav tako so združili obe sintezni poti, tako D-ksiloze in zeaksantina, kar pomeni, da so uspešno združili 8 genov, kar predstavlja približno 19 kb DNA. Učinkovitost tako pripravljenih biokemijskih poti je bila od 70-odstotna do 100-odstotna, ne glede na to, ali so celotno pot združili na plazmidu ali integrirali v kromosom kvasovk.

Za izvedbo te metode je samo potrebno pripraviti ustrezne fragmente DNA in transformirati kvasovke z mešanico teh skrbno načrtovanih fragmentov DNA. DNA združevanje predstavlja močno orodje za konstrukcijo biokemijskih poti v sintezni biologiji, metaboličnem inženirstvu in pri študijah funkcionalne genomike.

==Materiali in metode==
Pri delu so uporabili kvasovko ''S. cerevisiae'' YSG50, ki so jo gojili v mediju YPAD.
 
Za pripravo posameznih ekspresijskih kaset so uporabili promotorje in terminatorje, ki so jih pomnožili s PCR, iz izoliranje genomske DNA kvasovke S. cerevisiae YSG50. Uporabili so strukturne gene ksiloza reduktaza (XR), ksilitol dehidrogenaza (XDH), ksilulokinaza (XKS), CrtE, CrtB, CrtI, CrtY in CrtZ. HisG in δ2 sta bila pomnožena iz δ-integracijskega vektorja pdδUB.

Vsaka posamezna ekspresijska kaseta je bila pripravljena s PCR s podaljševanjem prekrivnih koncev (OE-PCR, ''angl. overlap extension PCR''), sledilo je čiščenje produktov z agarozno gelsko elektroforezo in izolacija posameznih fragmentov iz gela. Vsako individualno kaseto so zmešali z lineariziranim plazmidom pRS426m ali pRS416m in DNA precipitirali z etanolom. Pridobljeni DNA pelet so posušili in resuspendirali v vodi ter to zmes uporabili za transformacijo  ''S. cerevisiae''. Za izvedbo integracije v enem koraku, ciljno na δ mesta na kromosom ''S. cerevisiae'', so pripravili DNA mešanice posameznih kaset skupaj s fragmentom ''δ1-hisG-ura3-hisG'', ki so jih uporabili za trasformacijo ''S. cerevisiae''.

Transformacijo kvasovk ''S. cerevisiae'' so izvedli z elektroporacijo. Selekcijo so izvedli na trdnem gojišču SC-Ura. Izbrali so naključne kolonije, jih gojili v tekočem gojišču SC-Ura, izolirali plazmidno ali genomsko DNA ter opravili PCR analizo. Za vsako pot so izvedli PCR amplifikacijo vsake genske kasete iz izolirane plazmidne ali genomske DNA, tako so preverili vsebnost in pravilno združitev konstruktov.

Opravili so tudi fizikalno karakterizacijo rekombinantnih klonov. Z izoliranimi plazmidi iz kvasovk so transformirali sev ''E. coli'' BW25141, to gojili, izolirali plazmide, opravili restrikcijo z ''Bam''HI in ''Eco''RI, nanesli na agarozni gel in s tem preverili pravilnost restrikcijskega vzorca z agarozno gelsko elektroforezo.

Naredili so tudi funkcionalno analizo sestavljenih biosinteznih poti. Rekombinantno ''S. cerevisiae'', z D-ksilozno biosintezno potjo so analizirali s spremljanjem celične rasti v SC-Ura tekočem mediju z 2 % vsebnostjo D-ksiloze v mediju (SC-Ura + D-ksiloza), ki je predstavljala  edini vir ogljika. Zeaksantin so izolirali z acetonom iz ''S. cerevisiae'' s sintezno potjo s petimi ali osmimi geni ali kontrole s praznim vektorjem ter pridobljene vzorce analizirali na HPLC.

==Osnove metode DNA združevanja==
Da so dokazali, da koncept metode DNA združevanja deluje, so sestavili dve različni biosintezni poti iz več genov. Za vsak posamezen gen v sintezni poti so pripravili ekspresijske kasete, ki so vključevale promotor, strukturni gen in terminator. Vsaka kaseta je bila pomnožena s PCR in pripravljena z OE-PCR. 5'-konec prve ekspresijske kasete je bil dizajniran tako, da se je prekrival z vektorjem (ali pomožnim fragmentom, ki je nosil selekcijski marker in zaporedje potrebno za homologno rekombinacijo na tarčno δ mesto  kromosoma, za integracijo), med tem ko so bili 3'-konci dizajnirani, da so se prekrivali z naslednjo kaseto. Vsaka naslednja kaseta je bila načrtovana tako, da se je prekrivala s konci prejšnje in naslednje kasete, 3'-konec zadnje kasete se je prekrival z vektorjem (ali tarčnim lokusom kromosoma za intergracijo). Vsi prekrivajoči konci so bili načrtovani tako, da so se prekrivali v vsaj 40 bp za učinkovito in vivo homologno rekombinacijo. Tako načrtovane kasete so hkrati transformirali v ''S. cerevisiae'' z lineariziranim vektorjem (ali pomožnim fragmentom) z elektroporacijo, kar je omogočilo, da so se vse kasete združile v vektor ali integrirale v kromosom.

==Konstrukcija biosintezne poti D-ksiloze==
D-ksilozno biosintezno pot so konstruirali z encimi ksiloza reduktazo (XR), ksilitol dehidrogenazo (XDH) in ksilulokinazo (XKS). Posamezne kasete ''hisG-ADH1p-XR-ADH1t, PGK1p-XDH-CYC1t'' in ''PYK1p-XKS-ADH2t-δ2'' so ustrezno pripravili z OE-PCR ter produkte reakcije očistili z agarozno gelsko elektroforezo. Vse tri kasete so zmešali z lineariziranim vektorjem, precipitirali z etanolom in dobljeni pelet resuspendirali v vodi. S to mešanico so transformirali ''S. cerevisiae'' z elektroporacijo in kasneje selekcionirali.

Vzporedno so transformirali ''S. cerevisiae'' tudi z mešanico kaset ''hisG-ADH1p-XR-ADH1t, PGK1p-XDH-CYC1t'' ter ''PYK1p-XKS-ADH2t-δ2'' in fragmentom ''δ1-hisG-ura3-hisG'', ki nosi zapis za selekcijski marker ''ura3'' in δ sekvenco, ki je homologna delni sekvenci δ mesta na kromosomu ''S. cerevisiae''. Dve ponovljeni ''hisG'' sekvenci v ''δ1-hisG-ura3-hisG'' fragmentu se lahko uporabijo za izrez ''ura3'' iz kromosoma in se tako reciklira marker z uporabo 5-fluoroorotske kisline.

Za oboje, tako za plazmidno konstrukcijo, kot za kromosomsko integracijo sintezne poti so določili 80-odstotno do 100-odstotno učinkovitost metode DNA združevanja. Učinkovitost D-ksilozne poti so potrdili z rastjo kvasovk v gojišču brez glukoze, ki je kot edini vir ogljika predstavljala dodana D-ksiloza. Kvasovke, ki so imele vstavljene te tri gene sintezne poti D-ksiloze, so bile sposobne uporabiti D-ksilozo kot vir ogljika in so uspešno rastle. Kvasovke s praznim plazmidom, ki so služile kot kontrola, niso rastle, saj niso mogle uporabiti D-ksiloze.

==Konstrukcija biosintezne poti zeaksantina==
Za konstrukcijo biosintezne poti zeaksantina so pripravili posamezne kasete ''hisG-TEF1p-CrtE-PGIt, HXT7p-CrtB-TPI1t, TEF2p-CrtI-FBA1t, FBA1p-CrtY-ENO2t'' in ''PDC1p-CrtZ-THD2t-δ2'' z OE-PCR.  Vseh pet kaset so združili v pRS426m ali kromosom ''S. cerevisiae''.

Učinkovitost metode je bila visoka od 60-odstotna do 80-odstotna. Kvasovke, ki so vsebovale zeaksantinsko biosintezno pot so gojili v gojišču SC-Ura, da so uporabile vstavljeno biosintezno pot proizvodnje zeaksantina. Vsebnost zeaksantina v kvasovkah so dokazali tako, da so naredili izolacijo zeaksantina iz kvasovk z acetonom, vzorce so posušili in večkrat ponovili korak izolacije z acetonom. Tako pridobljene, suhe izolate so resuspendirali v metanolu in analizirali s tekočinsko kromatografijo visoke ločljivosti (HPLC). Dobljene rezultate HPLC so primerjali s čisto spojino zeaksantina, ki je služila kot standard, pri čemer so dobili enak vrh pri enakem času, med tem ko tega pika pri celičnem ekstraktu kontrol (kvasovka s praznim plazmidom pRS426) niso opazili.

==Konstrukcija kombinirane biosintezne poti D-ksiloze in zeaksantina==
Da je s to metodo mogoče sestaviti tudi večje sintezne poti, so ponazorili z združitvijo obeh biosinteznih poti v eno celoto. Združili so osem kaset ''hisG-ADH1p-XR-ADH1t, PGK1p-XDH-CYC1t, PYK1p-XKS-ADH2t, TEF1p-CrtE-PGIt, HXT7p-CrtB-TPI1t, TEF2p-CrtI-FBA1t, FBA1p-CrtY-ENO2t'' in ''PDC1p-CrtZ-TDH2t-δ2'', ki so jih ustrezno pripravili z OE-PCR.  ''S. cerevisiae'' so transformirali z mešanico vseh osmih kaset in lineariziranim vektorjem ali ''δ1-hisG-ura3-hisG''  fragmentom. 

Učinkovitost metode je bila odvisna od dolžine prekrivajočih se koncev, pri približno 50 bp je bila učinkovitost od 10-odstotna do 20-odstotna, pri 125 bp ali več pa je bila učinkovitost višja, od 40-odstotna do 70-odstotna. Izkazalo se je, da je učinkovitost metode DNA združevanja pri daljših sinteznih poteh pri katerih transformiramo v kvasovke z več DNA fragmenti, odvisna od dolžine prekrivajočih se koncev.

Kvasovke so uspešno gojili v mediju z D-ksilozo, kot edinim virom ogljika in s tem dokazali učinkovanje biosintezne poti D-ksiloze. Ravno tako so s HPLC detektirali zeaksantin, kar nakazuje na funkcionalno biosintezno pot zeaksantina.

==Vir==
Z. Shao, H. Zhao in H. Zhao: DNA assembler, an ''in vivo'' genetic method for rapid construction of biochemical pathways. Nucleic Acids Research. 2009, 37, 2, e16.