View source

Daljinsko upravljanje z sesalskimi celicami, na podlagi temperaturno reguliranih genetskih stikal s svetlobno-toplotnimi utripi

Uvod<br> 
Sintezna biologija nam omogoča nove načine regulacije celične aktivnosti. Ta je lahko regulirana preko različnih majhnih molekul, proteinov, svetlobe ipd. Zato se je razvilo celotno novo polje z imenom sintezna imunologija. Boljše poznavanje signaliziranja pa nam je omogočilo da oblikujemo popolnoma nove T celice, ki imajo dobro definirane lastnosti. Te lastnosti so med drugim specifična migracija proti tumorjem, proti kemičnim signalom in uporaba logičnih vrat, da zaznavajo specifične antigene. Vendar pa je njihova aplikacija zaenkrat še vedno omejena, saj je natančno izražanje T celic v specifičnih tkivih še vedno skoraj nemogoča. Prostorska komponenta je in vivo zelo pomembna, saj je izražanje T celic v napačnem tkivu lahko povzroči veliko neželenih učinkov. Zato so bile razvite Jurkat T celice.<br>
Uporabljene celice<br>
Uporabljene celice so bile modificirane Jurkat T celice, ki so regulirane preko toplotno aktiviranih genetskih stikal. Ideja za njihovo oblikovanje prihaja iz dejstva, da lahko brez prevelikih težav zelo natančno usmerimo pulze toplote na različne dele telesa. To lahko naredimo na več različnih načinov kot so lasersko segrevanje, indukcijsko segrevanje ali usmerjen ultrazvok. Najbolj znano genetsko stikalo je RNA termometer, vendar se po njem ne moremo preveč zgledovati saj ta obstaja samo v prokariontskih sistemih. Druga vrsta zelo učinkovitih toplotno reguliranih mehanizmov je delovanje HS (heat shock)  endogenih promotorjev. HS odziv se sproži že pri majhnem povišanju temperature (3-5 K). Jurkat T celice zato temeljijo na genetskih stikalih iz proteina toplotnega šoka 70B (HSPA6). Zato pri standardni telesni temperaturi 37 °C ni aktiven pri malo povišani temperaturi (40 °C) pa je aktivnost Jurkat T celic tudi 200-krat višja.<br>
Sintezno imunološka genetska stikala, ki temeljijo na svetlobi<br>
Čeprav so bila uporabljena toplotna genetska stikala, je bilo veliko govora o uporabi svetlobnih stikal, ki so sicer bolj raziskana, kot toplotna in imajo svoje prednosti in slabosti. Glavna prednost je uporaba svetlobe v nekaj že uveljavljenih poteh. Te so regulacija prehoda Ca2+ ionov in aktivacija NFAT (jedrni faktor aktiviranih T celic. Prav tako pa ne smemo pozabiti na opsine, ki začnejo celotno vrsto genetskih programov, ki se sprožijo ob stiku s svetlobnimi signali. Proti tumorsko delovanje rodopsina, s pomočjo katerega lahko usmerimo T celice, da napadejo tumorske celice. Prav tako lahko sprožimo različne učinke pri uporabi svetlobe različne valovne dolžine. Za razliko do toplotne regulacije ali kemijske regulacije za aktivacijo sintezno imunoloških stikal, je pri svetlobi porazporeditev signala, zelo časovno in prostorsko omejena. Prav tako ne pride do desenzitacije in zmanjšanja signalov, kar je težava pri marsikateri poti temperaturnega signaliziranja. Vendar pa je glavna šibkost svetlobnega signaliziranja prav tista, zaradi katere je toplotno označevanje bolj priljubljeno pri tej raziskovalni skupini. Glavna šibkost je omejena penetracija v tkiva. Tudi z modernejšimi tehnikami in uporabo NIR (bljižna infrardeča svetloba) lahko dosežemo penetracijo samo nekaj mm, tako da je tehnika z boljšo penetracijo zaželjena [2].<br>
Toplotno genetsko stikalo<br>
Genetsko stikalo pri Jurkat T celicah temelji na sesalskem faktorju toplotnega šoka 1 (HSF1). HSF1 je pri telesni temperaturi 37 °C neaktiven monomer. Ta se pri povišani temperaturi pretvori v homotrimer, ki se veže na odzivne strukture toplotnega šoka (HSE). Od njih so tudi odvisne značilnosti promotorja in posledično značilnosti toplotnega genetskega stikala. Izbran promotor, ki je bil tudi uporabljen v Jurkat T celicah, ni bil tisti, ki je imel največji signal pri 40-42 °C, ampak tisti, ki je imel največjo spremembo v aktivnosti, ko se je temperatura povečala iz 37 °C na 40-42 °C. Tako nizka temperatura je ključna, saj bi pri višji temperaturi lahko prišlo do poškodovanja tkiva. Za spremljanje aktivnosti je bil uporabljen Gluc reporter.<br>
Toplotna aktivacija genetske aktivnosti<br> 
Za določitev aktivnosti novonastalega toplotnega stikala so bili uporabljeni tako pulzi povišanja temperature, kot tudi neprekinjeno dodajanje toplote. S tem je bilo preverjeno, kateri sistem je bolj učinkovit za aktivacijo toplotnega stikala. Temperatura je bila zvišana na 39, 40, 41 in 42 °C. Prvi odziv se je poznal že, ko se je temperatura dvignila za samo 2 °C (200-krat večji odziv kot pri 37 °C po 60 min segrevanja na temperaturi 39 °C). Ker je bilo neprekinjeno segrevanje tako učinkovito pri sprožitvi signala, je bila v drugem koraku preizkušena še učinkovitost pulznega aktiviranja toplotnega stikala. Pri pulznem dodajanu toplote, so bile Jurkat T celice manj odzivne, saj so se resneje odzvale šele na pulzni signal pri 40 °C, kar je bilo pripisano lažji toleranci do manjših toplotnih preskokov. Ti rezultati so bili zelo spodbujajoči, saj je to pomenilo, da ni potrebno neprestano segrevanje celic za sprožitev signala in hkrati dodalo legitimnost idejo o aktivaciji Jurkat T celic z laserjem (ne kontinuirno ampak v pulzih).<br>
Fototermalna aktivacija T celic<br>
Fototermalna aktivacija Jurkat T celic, je njihova aktivacija z laserjem. V glavnem članku je bila uporabljena bljižna infrardeča svetloba (NIR). Za preverjanje delovanja tarčnega segrevanja je bila izbrana luciferazna aktivnost. Da je bila dokazana natančnost uporabe laserja, je raziskovalna skupina aktivirala celice in situ v obliki logotipa Georgia Tech. Aktivnost teh aktiviranih celic je bila preverjena in dokazana, da je 200-krat povečala luciferazno aktivnost v ciljnih celicah.<br>
Učinkovitost tega sistema je bila testirana tudi in vivo, kjer je bilo telo segreto na 42 °C na točno določenih delih. Luciferazna aktivnost je bila tam povečana za 100-krat. Če so segreli enake celice na 45 °C pa je bila luciferazna aktivnost povečana za 200-krat. To je bilo pripisano večinoma sistemski napaki, saj niso merili temperaturo tarčnih celic, ampak kože na površini, kar je lahko povzročilo razliko v temperaturi maksimalnega delovanja.<br>
Toplotni pulzi za T celice<br>
Jurkat T celice so se tako izkazale za zelo zanesljive, saj je bila njihova aktivacija zelo specifična, prav tako pa je bil tudi odziv dovolj signifikanten (200-kratno povečanje). Zato je bilo potrebno samo preveriti, če ostanjejo te celice aktivne tudi po daljšem obdobju (nekaj tednov) in ne samo po prvi aktivaciji. Temperaturna tolerance je ena izmed najpogostejših razlogov za odpoved delovanja temperaturnih signalov, zato so bili eksperimenti, ki so izvedeni čez več tednov zelo pomembni. Eksperimenti so bili izvedeni v obdobju 14 dni, ki so dokazali, da aktivnost celic v tem časovnem obdobju ni padla. Ravno nasprotno, vsi poskusi so pokazali, da je aktivnost celic (ki je bila spremljana z luciferazo) narasla štiri kratno glede na prvi dan testiranja. To je zelo pozitiven rezultat za kasnejšo aplikacijo Jurkat T celic v zdravljenju kroničnih bolezni kot je HIV, saj le ta iztroši T celice in je zato mnogo bolj potreben vnos novih, za katere pa si želimo, da bi čim dlje delovale.<br>
Zaključek<br>
Zaradi želje po bolj specifičnem izražanju aktivnosti T celic in vivo, so bile razvite posebne Jurkat T celice, ki se aktivirajo na podlagi genetskih stikal. Ta genetska stikala so aktivirana s pomočjo toplotne regulacije in so izredno specifična. Njihova specifičnost je tako velika, ker temeljijo na delovanju HSF1, ki se aktivira v območju med 40-42 °C. Prav tako pa je sprememba v aktivnosti do 200-kratna in se ne zmanjšuje ne glede na to, kako pogosto je genetsko stikalo aktivirano. Ker lahko aktiviramo Jurkat T celice z laserjem pomeni, da lahko zadenemo točno specifično tkivo v katerem želimo povečati aktivnost teh celic, brez da bi poškodovali tkivo. Temperature, ki jih pri tem dosežemo tudi niso škodljive za telo, saj se povečajo samo iz 37 °C na 42 °C in 45 °C  na koži. Ta mehanizem lahko sproži marsikatere nove raziskave na polu sintezne imunologije, saj lahko sedaj prvič z zelo natančnim sistemom tudi aktiviramo imunski sistem specifično v željenem tkivu.
Viri:
[1] Miller IC, Gamboa Castro M, Maenza J, Weis JP, Kwong GA. Remote Control of Mammalian Cells with Heat-Triggered Gene Switches and Photothermal Pulse Trains. ACS Synth Biol. 2018;7:1167–73.
[2] Gamboa L, Zamat AH, Kwong GA. Synthetic immunity by remote control. Theranostics. 2020;10(8):3652–3667. Published 2020 Feb 19. doi:10.7150/thno.41305