View source for Doseganje asimetričnosti in asimetrične delitve pri E. coli

''Povzeto po članku:'' [https://www.nature.com/articles/s41467-021-21135-1 Lin, DW., Liu, Y., Lee, YQ. et al. Construction of intracellular asymmetry and asymmetric division in ''Escherichia coli''. Nat Commun 12, 888 (2021). https://doi.org/10.1038/s41467-021-21135-1]
== Uvod ==
Asimetrična delitev celice je delitev, pri kateri nastaneta dve hčerinski celici, ki nimata enakih lastnosti. Med njima so lahko prisotne razlike v obliki in velikosti ter razporeditvi makromolekul in organelov. Ta pojav je značilen tako za nekatere prokariontske kot nekatere evkariontske celice. Asimetrično se delijo npr. človeške matične celice – nastane ena nova matična celica in ena celica, ki se bo diferencirala – pa tudi nekatere bakterije, npr. ''Caulobacter crescentus''. Da je delitev asimetrična, mora biti že pred njo v materinski celici vzpostavljena asimetrija oz. mora priti do polarizacije celice. To pomeni, da določeni celični mehanizmi poskrbijo za neenako razporeditev makromolekul v celici. Do tega lahko pride zaradi zunanjih ali notranjih dejavnikov [1].

== Celični mehanizmi za zagotavljanje asimetričnosti ==
Mehanizem doseganja asimetričnosti in proteinskega gradienta vključuje različne proteinske enote in interakcije med njimi. Mednje spadajo oligomerizacija proteinov in regulacije njihove difuzije. Nekatere od teh lastnosti so že okarakterizirane, mnoge pa še ne [1].

Pri polarizaciji evkariontske celice so ključni proteini PAR (angl. ''partitioning-defective proteins''). Mednje spadajo ogrodni proteini, ki služijo kot prijemališča za različne efektorske encime, včasih pa njihovo povezavo omogočajo tudi adaptorski proteini. Ključna posebnost proteinov PAR je, da na celični membrani oz. v njeni bližini tvorijo diskretne membranske domene, sestavljene iz določenih proteinov PAR, te pa so različne v posameznih delih celic – npr. na polih paličaste bakterijske celice. Pogosto neka skupina proteinov PAR izključuje drugo – torej izražanje ene skupine PAR na neki membranski domeni onemogoča nahajanje druge skupine PAR na istem mestu [2].

PopZ (angl. ''polar organizing protein'') je protein, ki ima osrednjo vlogo pri doseganju asimetričnosti bakterije ''Caulobacter crescentus''. Po nastanku najprej po celici prosto difundira, nato pa homooligomerizira in se usidra na enega izmed njenih polov. Tam deluje kot središče za interakcije z mnogimi drugimi proteini. Je intrinzično nestrukturiran protein z izjemo krajšega motiva, ki omogoča pripenjanje drugih proteinov [3]. 

Za asimetričnost pri Bacillus subtilis je najbolj pomemben protein DivIVA. Nahaja se predvsem v bližini negativno ukrivljenih membran. V paličasti obliki celice sta to predvsem njena pola. Zaenkrat ni točno znano, na kakšen način protein prepozna ukrivljenost, niti ni natančno poznana njegova struktura [4].

Za boljše razumevanje teh interakcij je uporaben sinteznobiološki pristop. ''E. coli'' je bakterija, ki se običajno deli simetrično. Z njenim manipuliranjem lahko ugotovimo, kateri so minimalni genetski elementi, ki določajo želen fenotip – asimetrično delitev celice. To naredimo tako, da gene iz drugih organizmov, ki ta pojav regulirajo, vnesemo v ''E. coli'', saj tako nanje ne vpliva morebitna intrinzična regulacija [5].

== Doseganje asimetričnosti in asimetrične delitve pri ''E. coli'' ==
=== PopZ kot ogrodni protein za lokalizacijo efektorskih proteinov ===
Raziskovalci so asimetričnost celice ''E. coli'' najprej poskušali doseči z vnosom gena za protein PopZ. Da bi ga lahko zasledovali, so uporabili fuzijo z rdečim fluorescirajočim proteinom (mRFP-PopZ). Uporabili so ti. Andersonov promotor J23116, ki je eden izmed standardnih bioloških delov [6]. Izražanje gena s tem promotorjem je zmerno intenzivno, sintetiziran protein pa se nahaja le na enem polu celice v jasno definiranem območju z ostro mejo. Po celični delitvi se ves izražen PopZ nahaja zgolj v eni celici – tisti, ki je nastala iz ustreznega pola. Pri uporabi skrajšane različice PopZ, ki ne vsebuje C-končne domene, pomembne za oligomerizacijo proteina, je protein po izražanju razporejen po celotni celici in se pri delitvi enakomerno razdeli med hčerinski celici. Protein PopZ torej lahko povzroči asimetričnost celice, za kar pa je nujno potrebna njegova oligomerizacija [5].

PopZ v ''C. crescentus'' deluje kot ogrodje za pripenjanje ostalih proteinov in tako zagotavlja njihovo asimetrično porazdelitev. Cilj nadaljevanja raziskave je bil ugotoviti, ali tako funkcijo lahko protein ohrani tudi v ''E. coli''. Eden izmed proteinov, ki se vežejo na PopZ je SpmX, ta pa potem deluje kot adaptor za nadaljnjo vezavo drugih proteinov. Aktivna je že njegova skrajšana oblika SpmXΔC, ki vsebuje N-končen del [7]. Pri izražanju proteina SpmXΔC s fuzijskim reporterjem sfGFP (zeleni fluorescirajoči protein) in konstrukta mRFP-PopZ pride do prekrivanja fluorescence reporterjev na enem izmed polov celice. Proteina torej kolokalizirata, kar dokazuje, da interagirata in PopZ tudi v ''E. coli'' ohrani ogrodno funkcijo za vezavo ostalih proteinov [5]. 

Adaptor SpmX lahko služi za vezavo nekega efektorskega proteina z encimsko aktivnostjo. V takem primeru je izražena funkcija ogrodnega proteina PopZ, da omogoči funkcionalnost nekemu efektorskemu proteinu zgolj na enem izmed polov celic. Za preučevanje možnosti tega procesa v ''E. coli'' je bila kot efektor izbrana RNA-polimeraza T7 oz. njena optimizirana oblika. Uporabljena RNA-polimeraza je bila razdeljena na dva dela, N-končni in C-končni, na vsakega od teh pa je bil v vseh poskusih pripet adaptor SpmXΔC. Raziskovalci so želeli potrditi hipotezo, da lahko lokalizacija obeh delov na celičnem polu privede obe polovici dovolj skupaj, da je polimeraza aktivna. Predhodno so v raziskavi izražali vsako polovico RNA-polimeraze T7 s fuziranim SpmXΔC in reporterjem sfGFP posebej (konstrukta N-RNAP-sfGFP-SpmXΔC oz. SpmXΔC-sfGFP-C-RNAP), toda hkrati z mRFP-PopZ. S poskusom so pokazali, da tudi taka konstrukta protein PopZ pričakovano uspešno prostorsko omeji le na en celični pol [5]. 

=== Zasnova ustreznih genetskih vezij ===
V osrednjem delu raziskave so bila zasnovana tri genetska vezja, vsako predstavlja nadgradnjo prejšnjega. Prvo genetsko vezje vsebuje naslednje elemente: gen za konstrukt mRFP-PopZ z Andersonovim promotorjem, zapisa za fuziji adaptorja SpmXΔC s posameznim delom RNA-polimeraze T7 (''eT7pN-spmXN'' oz. ''spmXN-eT7PC'') s promotorjem ''Ptac'', gen za reporter sfGFP s promotorjem ''PT7'' in zapis za represor Lac s svojim promotorjem. Kontrolo predstavlja vezje brez zapisa za mRFP-PopZ. V bakterijah s prvim vezjem, ko je izražen tudi mRFP-PopZ, je zelena fluorescenca bistveno intenzivnejša kot v kontrolnem poskusu. To pomeni, da je prišlo do uspešnega sestavljanja RNA-polimeraze T7 in izražanja gena sfGFP, ki ima promotor, na katerega se veže obravnavna polimeraza. Poskus jasno pokaže tudi, da je RNA-polimeraza T7 lokalizirana na polu bakterije, torej tam deluje, kar pomeni da lahko ogrodni sistem z osrednjim proteinom PopZ uspešno zasidra efektorske encime na polu celice [5].

Pri uporabi prvega genetskega vezja produkt sfGFP prosto difundira po celici, torej ta sistem kljub nahajanju na celičnem polu ne omogoča asimetrične razporeditve ostalih proteinov, ki nastanejo kasneje v sintezni poti. Da bi asimetrijo dosegli, so raziskovalci skonstruirali prilagojeno, drugo genetsko vezje. Njegov pomemben element je protein DivIVA. Predhodno so v raziskavi pokazali, da se sam protein DivIVA v obliki fuzije z reporterjem sfGPF nahaja na obeh polih celice ''E. coli'', ne pa prosto po celici, kar je potrditev tega, da prepozna negativno ukrivljeno membrano. Pokazano je bilo tudi, da se proteina DivIVA in PopZ ne izključujeta. To pomeni, da se ob skupnem izražanju mRFP-PopZ in DivIVA-sfGFP prvi pričakovano nahaja na enem polu celice, DivIVA pa na obeh, tako kot če bi bila izražena vsak posebej, in se prostorsko ne ovirata [5]. 

V prvem genetskem vezju je bil kot reporter izbran gen za sfGFP, ki prosto difundira, v drugem pa sfGFP, vezan na DivIVA (DivIVA-sfGFP). Kontrolo predstavlja vezje brez zapisa za mRFP-PopZ. V bakterijah z drugim vezjem je zelena fluorescenca bistveno bolj intenzivna na enem polu, tistem, na katerem je lokalizirana tudi RNA-polimeraza T7 (vidna kot rdeča fluorescenca zaradi posredne vezave na mRFP-PopZ). V kontrolnem poskusu je zelena fluorescenca zanemarljiva. Dodatni poskusi so pokazali tudi, da je difuzijski koeficient konstrukta DivIVA-sfGFP manjši kot od samega sfGFP, torej zadnji lažje difundira. Celostno so torej rezultati potrdili, da pri uporabi drugega vezja pride do gradienta proteina, katerega gen je za promotorjem T7. Ob prisotnosti proteinov PopZ, SpmX in DivIVA lahko torej dosežemo proteinski gradient, če želen protein interagira s proteinom DivIVA [5].
 
Tretje genetsko vezje je bilo dodatno prilagojeno na tak način, da je omogočalo doseči drugačne fenotipe hčerinskih celic po delitvi asimetrične matične celice ''E. coli''. Tretji sistem kot reporterski protein vsebuje fuzijo proteinov DivIVA, sfGFP in AmpC – β-laktamaze, ki omogoča odpornost na antibiotik ampicilin. Kontrolo predstavlja vezje brez zapisa za mRFP-PopZ. V celici s takim vezjem je dosežena podobna asimetričnost kot pri drugem sistemu z dodatno razliko. Po delitvi celice je bil obema hčerinskima celicama dodan antibiotik ampicilin. Tista celica, ki je podedovala celični pol s kompleksom obravnavanih proteinov, torej tudi β-laktamazo, je preživela bistveno dlje časa kot tista, ki ni pridobila odpornosti na ampicilin. Pri kontrolnem poskusu sta obe hčerinski celici umrli približno enako hitro. Tak sistem torej ne omogoča le doseganja asimetrije v celici, temveč tudi asimetrično delitev z nastankom dveh celic z različno usodo [5].

== Zaključek ==
V povzeti raziskavi so potrdili, da sta proteina PopZ in DivIVA osnovni enoti za doseganje asimetričnosti in asimetrične delitve v celici. Pri tem imata ključno vlogo oligomerizacija in omejena difuzija teh proteinov. Ugotovili so, da lahko ''E. coli'', ki se naravno deli simetrično, samo z izražanjem omenjenih proteinov (in adaptorja SpmX) spremenimo tako, da se polarizira in deli asimetrično. PopZ poskrbi za lokalizacijo proteinov zgolj na enem celičnem polu, DivIVA pa za gradient efektorskega proteina. Raziskava je primer uporabe principov sintezne biologije – rekonstrukcijo organizmov z dodajanjem novih genetskih vezij lahko izkoristimo za preučevanje slabše poznanih celičnih mehanizmov.

== Viri ==
[1]	B. Sunchu and C. Cabernard, “Principles and mechanisms of asymmetric cell division,” ''Development (Cambridge)'', vol. 147, no. 13. Company of Biologists Ltd, Jun. 29, 2020, doi: 10.1242/dev.167650.

[2]	N. W. Goehring, “PAR polarity: From complexity to design principles,” ''Exp. Cell Res.'', vol. 328, no. 2, pp. 258–266, 2014, doi: 10.1016/j.yexcr.2014.08.009.

[3]	C. T. Nordyke, Y. M. Ahmed, R. Z. Puterbaugh, G. R. Bowman, and K. Varga, “Intrinsically Disordered Bacterial Polar Organizing Protein Z, PopZ, Interacts with Protein Binding Partners Through an N-terminal Molecular Recognition Feature,” ''J. Mol. Biol.'', vol. 432, no. 23, pp. 6092–6107, Nov. 2020, doi: 10.1016/j.jmb.2020.09.020.

[4]	K. S. Ramamurthi and R. Losick, “Negative membrane curvature as a cue for subcellular localization of a bacterial protein,” ''Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A.'', vol. 106, no. 32, pp. 13541–13545, Aug. 2009, doi: 10.1073/pnas.0906851106.

[5]	D.-W. Lin et al., “Construction of intracellular asymmetry and asymmetric division in ''Escherichia coli'',” ''Nat. Commun.'', vol. 12, no. 1, pp. 1–11, Dec. 2021, doi: 10.1038/s41467-021-21135-1.

[6]	J. R. Kelly et al., “Measuring the activity of BioBrick promoters using an in vivo reference standard,” ''J. Biol. Eng.'', vol. 3, Apr. 2009, doi: 10.1186/1754-1611-3-4.

[7]	S. K. Radhakrishnan, M. Thanbichler, and P. H. Viollier, “The dynamic interplay between a cell fate determinant and a lysozyme homolog drives the asymmetric division cycle of ''Caulobacter crescentus'',” ''Genes Dev.'', vol. 22, no. 2, pp. 212–225, Jan. 2008, doi: 10.1101/gad.1601808.