Hachimoji DNA in RNA: genetski kod z osmimi gradniki

From Wiki FKKT

(Difference between revisions)
Jump to: navigation, search
Current revision (08:45, 26 May 2020) (view source)
 
Line 21: Line 21:
Iskanje odgovora na vprašanje, ali je informacijo, zapisano v hachimoji DNA, mogoče prepisati v t.i. hachimoji RNA (oz. RNA na osnovi 8-črkovnega genetskega koda). Pripravljena so bila štiri modelna DNA zaporedja, ki so vsebovala zgolj po eno nestandardno bazo, ki ji je sledil citozin (na komplementarni verigi pa gvanin). Na osnovi omenjenih zaporedij je bila izvedena transkripcija, pri čemer so RNA transkripti vsebovali z radioaktivnim fosforjem označene mostovne alfa-fosfate citozin nukleotidov. Po razgradnji z ribonukleazo T2 (ki je generirala mešanico nukleozid 3'-fosfatov) so raziskovalci izvedli 2D tankoplastno kromatografijo, kjer so primerjali ujemanje hachimoji 3'-fosfatov v mešanici s sintetičnimi nukleozid 3'-fosfati. Eksperiment je pokazal, da je vgradnja nestandardnih nukleotidov v RNA možna in da nativna T7 RNA polimeraza (ki so jo uporabili v poskusu) ob prisotnosti dP na matrici v verigo inkorporira rZTP in obratno ter v prisotosti dS inkorporira rBTP. Po drugi strani se rSTP v prisotnosti dB na matrici v verigo ne inkorporira, kar bi lahko pripisali zmanjšani elektronski gostoti v malem žlebu aminopiridonskega heterocikla dSTP. Transkripti so bili tako v primeru prisotnosti dB na matrici krajši, saj se je transkripcija predhodno zaustavila, kar je pokazala tudi analiza transkriptov s PAGE. Predpostavlja se, da polimeraze prepoznavajo določeno elektronsko gostoto, ki je sicer prisotna pri vseh ostalih nukleotidih [1].
Iskanje odgovora na vprašanje, ali je informacijo, zapisano v hachimoji DNA, mogoče prepisati v t.i. hachimoji RNA (oz. RNA na osnovi 8-črkovnega genetskega koda). Pripravljena so bila štiri modelna DNA zaporedja, ki so vsebovala zgolj po eno nestandardno bazo, ki ji je sledil citozin (na komplementarni verigi pa gvanin). Na osnovi omenjenih zaporedij je bila izvedena transkripcija, pri čemer so RNA transkripti vsebovali z radioaktivnim fosforjem označene mostovne alfa-fosfate citozin nukleotidov. Po razgradnji z ribonukleazo T2 (ki je generirala mešanico nukleozid 3'-fosfatov) so raziskovalci izvedli 2D tankoplastno kromatografijo, kjer so primerjali ujemanje hachimoji 3'-fosfatov v mešanici s sintetičnimi nukleozid 3'-fosfati. Eksperiment je pokazal, da je vgradnja nestandardnih nukleotidov v RNA možna in da nativna T7 RNA polimeraza (ki so jo uporabili v poskusu) ob prisotnosti dP na matrici v verigo inkorporira rZTP in obratno ter v prisotosti dS inkorporira rBTP. Po drugi strani se rSTP v prisotnosti dB na matrici v verigo ne inkorporira, kar bi lahko pripisali zmanjšani elektronski gostoti v malem žlebu aminopiridonskega heterocikla dSTP. Transkripti so bili tako v primeru prisotnosti dB na matrici krajši, saj se je transkripcija predhodno zaustavila, kar je pokazala tudi analiza transkriptov s PAGE. Predpostavlja se, da polimeraze prepoznavajo določeno elektronsko gostoto, ki je sicer prisotna pri vseh ostalih nukleotidih [1].
-
Zaradi neuspele vgradnje dSTP so se znanstevniki odločili poiskati različico T7 RNA polimeraze, ki bi bila zmožna vgradnje tudi teh gradnikov. Tako so odkrili različico, t.i. »FAL«, ki je bila še posebej učinkovita pri vgrajevanju dSTP, uspešna pa je bila tudi pri vgrajevanju vseh ostalih nestandardnih nukleotidov v transkripte [1].
+
Zaradi neuspele vgradnje rSTP so se znanstevniki odločili poiskati različico T7 RNA polimeraze, ki bi bila zmožna vgradnje tudi teh gradnikov. Tako so odkrili različico, t.i. »FAL«, ki je bila še posebej učinkovita pri vgrajevanju rSTP, uspešna pa je bila tudi pri vgrajevanju vseh ostalih nestandardnih nukleotidov v transkripte [1].
=== Sinteza in testiranje špinačnega fluorescenčnega hachimoji RNA aptamera ===
=== Sinteza in testiranje špinačnega fluorescenčnega hachimoji RNA aptamera ===

Current revision

Povzeto po članku: Hoshika, Shuichi, et al. »Hachimoji DNA and RNA: A Genetic System with Eight Building Blocks.« Science, vol. 363, št. 6429, 2019, str. 884–887.
URL: https://science.sciencemag.org/content/363/6429/884

Contents

Uvod

Za vse biološke sisteme je značilno shranjevanje, prenos in evolucija (oz. spreminjanje) genetske informacije. V moderni biologiji to vlogo opravlja molekula DNA, pri kateri se posamezni verigi preko tvorbe vodikovih vezi med komplementarnimi baznimi pari združujeta v dvojno vijačico [1]. Naj na tej točki predstavim pojem t.i. darwinizma. Darwinizem pravzaprav postavlja ločnico med živim in neživim stanjem – v molekularnem svetu pa temelji na replikaciji z napakami, kjer se tudi napake lahko replicirajo pod vplivom selekcijskega pritiska, kar omogoči nastanek »boljših« informacij. Prvi pogoj, ki ga mora izpolnjevati biopolimer, da zadošča pogojem darwinizma, je zmožnost tvorbe t.i. Schrödingerjevega aperiodičnega kristala, kjer se različne komponente molekule umeščajo v eno samo kristalno mrežo. Aperiodičen kristal naj bi se namreč repliciral z majhnim številom napak, morebitne napake, ki bi se pojavile, pa bi tudi se tudi same lahko replicirale z manjhnim številom napak, kar bi omogočilo nastanek »boljših« informacij [2]. Pri molekuli DNA naj bi prav regularnost v velikosti gradnikov omogočala tvorbo aperiodičnega kristala. Ostali dve lastnosti, ki jih morajo izpolnjevati biopolimeri, pa sta še polielektrolitsko ogrodje in termodinamska stabilnost molekule [1].

Poleg komplementarnosti v velikosti se v molekuli DNA pojavlja že prej omenjena komplementarnost pri tvorjenju vodikovih vezi, ki naj sicer ne bi bila nujen pogojen darwinističnih molekul, vsekakor pa predstavlja pomembno prednost. Prisotnost vodikovih vezi med komplementarnimi baznimi pari namreč zmanjša verjetnost, da baze zdrsnejo ena nad drugo, kar posledično zmanjša stabilnost dvojne vijačnice, vodi pa lahko tudi do izgube uniformnosti aperiodičnega kristala [1].

Hachimoji DNA in RNA

Ko v molekulo DNA inkorporiramo dodatne nukleotide, ki se med seboj povezujejo z vodikovimi vezmi, dobimo molekule, ki izkazujejo podobne karakteristike kot klasične DNA molekule. Opravljene so bile že študije na DNA molekulah s 6-črkovnim genetskim kodom, ki so pokazale, da se omenjene molekule lahko replicirajo, prepisujejo v RNA molekule na osnovi 6-črkovnega koda, ki se lahko ponovno prepišejo v DNA molekule ali pa omogočajo sintezo proteinov z dodatnimi aminokislinskimi ostanki [1].

V predstavljeni raziskavi so si avtorji za izziv zadali načrtovanje molekul na osnovi 8-črkovnega genetskega koda (od tod tudi ime hachimoji – »hachi« namreč pomeni osem, »moji« pa črka), ki zadoščajo pogoju Schrödingerjevega aperiodičnega kristala, gradniki pa se (preko vodikovih vezi) povezujejo v Watson-Crickove bazne pare. Prvi korak je predstavljala sinteza dveh setov heterociklov z dvema različnima vzorcema tvorbe vodikovih vezi, ki lahko tvorijo še dva dodatna para. Sledila je termodinamska analiza zaporedij na osnovi 8-črkovnega koda, analiza kristalnih struktur, poskus prepisovanja informacije z DNA v RNA (prav tako na osnovi 8-črkovnega koda) in za konec še sinteza in testiranje špinačnega fluorescenčnega RNA aptamera, kar bo podrobneje predstavljeno v nadaljevanju [1].

Termodinamska analiza DNA

Osemčrkovni genetski kod je vseboval baze, pri čemer je prišlo do tvorbe baznih parov G:C, A:T, Z:P in S:B. Donorji vodikovih vezi so na sliki označeni z modro barvo, akceptorji pa z rdečo. V okviru termodinamske analize je bilo s pomočjo fosforamiditne metode pripravljenih 94 dupleksov DNA, ki so jim eksperimentalno ocenili termodinamske parametre za razvitje molekule ter le-te primerjali s parametri, ocenjenimi na osnovi zaporedja DNA po metodi najbližjih sosedov za standardne DNA duplekse. Primerjave so pokazale zelo dobro ujemanje eksperimentalnih z napovedanimi vrednostmi. To potrjuje, da DNA na osnovi 8-črkovnega genetskega koda izkazuje podobno »obnašanje« kot standardne DNA molekule, kar implicira, da ima lahko tudi vlogo informacijskega sistema [1].

Analiza kristalnih struktur

Preverjanje naslednjega darwinističnega pogoja – in sicer ali 8-črkovni genetski kod omogoča pojav novih mutacij, ne da bi ob tem prišlo do spremembe Schrödingerjevega aperiodičnega kristala. V ta namen so bile pridobljene kristalne strukture treh različnih DNA dupleksov na osnovi samo-komplementarnih zaporedij dolžine 16 nukleotidov v kompleksu z reverzno transkriptazo Moloneyevega virusa mišje levkemije. Kompleksi so vsebovali po dve proteinski molekuli z vezano dvojno vijačnico v sredini, pri čemer so bile interakcije med proteinom in nukleinsko kislino omejene le na konce, kar pomeni, da je 3D strukturo (oz. položaj) preostalih 10 baznih parov določalo le nukleotidno zaporedje. Izkazalo se je, da je hachimoji DNA v vseh treh strukturah zavzela B obliko. Velikost velikega in malega žleba je pri hachimoji DNA podobna kot v primeru DNA, ki je v osrednjem delu zaporedja vsebovala G in C nukleotide, vendar drugačna kot pri DNA, ki je na istem delu vsebovala zgolj A in T nukleotide. Pojavlja se tudi nekaj sprememb v orientaciji baz glede na druge baze, s katerimi tvorijo bazne pare. Za S:B pare so v dveh strukturah opazili podoben »propelerski«, vendar nekoliko večji »odpiralni« kot v primerjavi z G:C baznim parom na enaki poziciji. P:Z par v okolici naravnih baznih parov v primerjavi z G:C baznim parom izkazuje večji »zapončni« kot. Kljub manjšim razlikam v strukturnih parametrih avtorji članka ocenjujejo, da hachimoji DNA kljub manjšim spremembam v zaporedju tvori praktično enak aperiodičen kristal kot DNA na osnovi 4-črkovnega koda. Hachimoji DNA tako v skladu z darwinistično zahtevo predstavlja mutabilen sistem za shranjevanje informacij [1].

Transkripcija hachimoji DNA v hachimoji RNA

Iskanje odgovora na vprašanje, ali je informacijo, zapisano v hachimoji DNA, mogoče prepisati v t.i. hachimoji RNA (oz. RNA na osnovi 8-črkovnega genetskega koda). Pripravljena so bila štiri modelna DNA zaporedja, ki so vsebovala zgolj po eno nestandardno bazo, ki ji je sledil citozin (na komplementarni verigi pa gvanin). Na osnovi omenjenih zaporedij je bila izvedena transkripcija, pri čemer so RNA transkripti vsebovali z radioaktivnim fosforjem označene mostovne alfa-fosfate citozin nukleotidov. Po razgradnji z ribonukleazo T2 (ki je generirala mešanico nukleozid 3'-fosfatov) so raziskovalci izvedli 2D tankoplastno kromatografijo, kjer so primerjali ujemanje hachimoji 3'-fosfatov v mešanici s sintetičnimi nukleozid 3'-fosfati. Eksperiment je pokazal, da je vgradnja nestandardnih nukleotidov v RNA možna in da nativna T7 RNA polimeraza (ki so jo uporabili v poskusu) ob prisotnosti dP na matrici v verigo inkorporira rZTP in obratno ter v prisotosti dS inkorporira rBTP. Po drugi strani se rSTP v prisotnosti dB na matrici v verigo ne inkorporira, kar bi lahko pripisali zmanjšani elektronski gostoti v malem žlebu aminopiridonskega heterocikla dSTP. Transkripti so bili tako v primeru prisotnosti dB na matrici krajši, saj se je transkripcija predhodno zaustavila, kar je pokazala tudi analiza transkriptov s PAGE. Predpostavlja se, da polimeraze prepoznavajo določeno elektronsko gostoto, ki je sicer prisotna pri vseh ostalih nukleotidih [1].

Zaradi neuspele vgradnje rSTP so se znanstevniki odločili poiskati različico T7 RNA polimeraze, ki bi bila zmožna vgradnje tudi teh gradnikov. Tako so odkrili različico, t.i. »FAL«, ki je bila še posebej učinkovita pri vgrajevanju rSTP, uspešna pa je bila tudi pri vgrajevanju vseh ostalih nestandardnih nukleotidov v transkripte [1].

Sinteza in testiranje špinačnega fluorescenčnega hachimoji RNA aptamera

V standardni obliki špinačni aptamer spremeni sekundarno strukturo in veže fluorofor 3,5-difluoro-4-hidroksibenziliden imidazolinon, ki ob vezavi fluorescira zeleno. Za pripravo aptamera je bila uporabljena RNA polimeraza FAL, aptamer pa je vseboval še nekaj dodatnih nestandardnih nukleotidov na skrbno izbranih mestih, da se pri tem ne bi spremenilo zvitje molekule. Flourescenco je bilo moč zaznati pod UV-svetlobo tako v vzorcu standardnega aptamera kot v vzorcu hachimoji aptamera v primeru, ko je bil prisoten tudi fluorofor. Ko je bil prisoten zgolj fluorofor, fluorecence ni bilo zaznati. Sintetitziran je bil tudi aptamer, ki je imel na mestu 50 vgrajen Z nukleotid, zamenjan pa je bil še en dodatni bazni par. Avtorji so predpostavljali, da bo vgrajen Z nukleotid dovolj blizu vezavnemu mestu za fluorofor, da bo prišlo do strukturnih sprememb aptamera, zato fluorofor ne bo več fluoresciral. Domneve so bile potrjene, zanimivi pa so rezultati analize s cirkularnim dikroizmom, ki kažejo, da ni prišlo do sprememb v zvitju. Celoten eksperiment je ovrgel pomisleke, da bi se nestandardni nukleotidi pogosteje napačno vgrajevali v zaporedja, saj bi v tem primeru najverjetneje prišlo do spremembe zvitja, zaradi česar se fluorescenca ne bi pojavila ali pa bi se Z nukleotid vgradil predaleč od vezavnega mesta fluorofora, da bi lahko prekinil fluorescenco [1].

Zaključek

Skozi celoten članek so avtorji pokazali, da je mogoče osnovati mutabilen genetski sistem z osmimi različnimi gradniki. S podvojitvijo gostote informacij in predvidljivo stopnjo stabilnosti struktur se pojavljajo ideje za mnoge aplikacije hachimoji DNA, kot so: črtno kodiranje, kombinatorno označevanje, shranjevanje obnovljivih informacij in uporaba v samosestavljivih nanostrukturah. Poleg tega strukturne razlike med posameznimi dupleksi niso pri hachimoji DNA nič večje kot pri standardni DNA, kar pomeni, da bi sistem lahko podpiral evolucijo na molekularnem nivoju. Raziskava je med drugim izpostavila pomembnost tvorbe baznih parov preko povezovanja z vodikovimi vezmi v tovrstnih mutabilnih informacijskih sistemih, razširila pa je tudi nabor struktur, s katerimi se bomo morda nekoč pri raziskovanju vesolja srečali še v naravni, nesintetični obliki [1].

Literatura

[1] Hoshika, Shuichi, et al. »Hachimoji DNA and RNA: A Genetic System with Eight Building Blocks.« Science, vol. 363, št. 6429, 2019, str. 884–887.

[2] Karalkar, Nilesh B. in Steven A. Benner. »The Challenge of Synthetic Biology. Synthetic Darwinism and the Aperiodic Crystal Structure.« Current Opinion in Chemical Biology, vol. 46, 2018, str. 188–195.

Personal tools