Hepadnavirusi in kavlimovirusi (DNA-virusi z reverzno transkripcijo): Difference between revisions

From Wiki FKKT
Jump to navigationJump to search
No edit summary
 
(11 intermediate revisions by 2 users not shown)
Line 1: Line 1:
== Biokemijske in molekularno biološke značilnosti ==


== [[Biokemijske in molekularno biološke značilnosti]] ==
=== Struktura in sestavljanje ovojnice ===
'''Hepadnavirusi''' so majhni sferični virusni delci z ovojnico. V premeru merijo 40 nm. Virusna kapsida je ikozaedrične oblike. V nukleokapsidi vsebujejo zelo majhen genom, ki ga sestavlja 3 – 4 kb. Genom je delno dvoverižni in enoverižni DNA. Enoverižna regija je krajša, poljubne dolžine in je posledica prekinitve sinteze druge verige DNA z reverzno transkriptazo med zorenjem virusa. Dolžine posameznih verig se med predstavniki razlikujejo. Nobena od verig ne tvori kovalentno zaključenega kroga. Minus veriga se na svojem 5' – koncu povezuje s tirozinskim ostankom proteina P. Komplementarna plus veriga se povezuje na kratko RNA pokrito s kapo. Konca DNA se povezujeta z vodikovimi vezmi na dve ponavljajoči zaporedji (DR1 in DR2), kar omogoča krožno strukturo.<br
/>Genom v primeru hepatitis B virusa kodira sedem virusnih proteinov:<br
/>- Trije površinski glikoproteini: LS, MS in SS.<br
/>- Jedrni proteini: C, ki tvori nukleokapsido in E, ki ga najdemo med nukleokapsido in ovojnico.<br
/>- Polimeraza (reverzna transkiptaza): P, ki jo sestavlja več domen; N-terminalna domena, ki je ''primer'' na minus verigi DNA, domeno reverzne transkriptaze in ribonukleazno H domeno.<br
/>- Regulatorni protein: X, ki aktivira transkripcijo genov preko vezave na jedrne transkripcijske regulatorje.


'''Struktura in sestavljanje ovojnice'''
'''Kavlimovirusi''' so edina znana skupina rastlinskih virusov z dvoverižno DNA (dsDNA) in nimajo lipidne ovojnice. Ikozaedrična kapsida je velika 50 nm in jo sestavlja 420 kapsidnih proteinov. Proteinska lupina je prekrita z VAP (z virionom povezani proteini). V proteinski lupini je krožna virusna DNA, ki vsebuje prekinitve enoverižnih delov dsDNA. Kje te prekinitve so in koliko jih je, je odvisno od posamezne vrste virusa. Torej nobena izmed verig ne tvori kovalentno zaključenega kroga. 5’ konci dsDNA se prekrivajo, kar je posledica reverzne transkripcije, saj se proces pravočasno ne ustavi. Sestavljena je iz 8 kb, kar se prepiše v 6 - 7 proteinov.  Ti so (na primeru cvetačnega mozaičnega virusa (CaMV)):<br
Hepadnavirusi so majhni sferični virusni delci z ovojnico. V premeru merijo 40 nm. Virusna kapsida je ikozaedrične oblike. V nukleokapsidi vsebujejo zelo majhen genom, ki ga sestavlja 3 – 4 kb. Genom je delno dvoverižni in enoverižni DNA. Enoverižna regija je krajša, poljubne dolžine in je posledica prekinitve sinteze druge verige DNA z reverzno transkriptazo med zorenjem virusa. Dolžine posameznih verig se med predstavniki razlikujejo. Nobena od verig ne tvori kovalentno zaključenega kroga. Minus veriga se na svojem 5' – koncu povezuje s tirozinskim ostankom proteina P. Komplementarna plus veriga se povezuje na kratko RNA pokrito s kapo. Konca DNA se povezujeta z vodikovimi vezmi na dve ponavljajoči zaporedji (DR1 in DR2), kar omogoča krožno strukturo.
/>- Transaktivator/viroplazmin (TAV): translacijski transaktivator, tvori vključitveno telesce, sodeluje pri reverzni transkripciji, sestavlja tubule za prenos virusa v sosednjo celico.<br
Genom v primeru hepatitis B virusa kodira sedem virusnih proteinov:
/>- Poliprotein (Pol): razstavi se na:<br
- Trije površinski glikoproteini: LS, MS in SS.
/>aspartatno proteazo, ki sodeluje pri modifikaciji virusnih proteinov,<br
- Jedrni proteini: C, ki tvori nukleokapsido in E, ki ga najdemo med nukleokapsido in ovojnico.
/>reverzno transkriptazo/RNAzo H, ki sodelujeta pri reverzni transkripciji.<br
- Polimeraza (reverzna transkiptaza): P, ki jo sestavlja več domen; N-terminalna domena, ki je primer na minus verigi DNA, domeno reverzne transkriptaze in ribonukleazno H domeno.
/>Kapsidni protein (CP): proteini, ki sestavljajo kapsido viriona, ima motiv Zn prsta, kar bi lahko omogočalo vezavo na nukleinske kisline.<br
- Regulatorni protein: X, ki aktivira transkripcijo genov preko vezave na jedrne transkripcijske regulatorje.
/>- Z virionom povezan protein (VAP): polipeptid, ki se veže na nukleinske kisline, najdemo ga v vključitvenih telescih in virusnih delcih (brez C konca, ki omogoča vezavo na nukleinske kisline, sodeluje pri prenašanju virusa; esencialen za kužnost virusa).<br
 
/>- ATF (na uš prenašalni faktor): tvori vključitveno telesce, interagirajo z virusnimi delci in tubuli ter oblogo kutikule na sesalu uši – prenositveni faktor.<br
Kavlimovirusi so edina znana skupina rastlinskih virusov z dvoverižno DNA (dsDNA). Nimajo lipidne ovojnice. Ikozaedrična kapsida je velika 50 nm in jo sestavlja 420 kapsidnih proteinov. Proteinska lupina je prekrita z VAP (z virionom povezani proteini). V proteinski lupini je krožna virusna DNA, ki vsebuje prekinitve enoverižnih delov dsDNA. Kje te prekinitve so in koliko jih je, je odvisno od posamezne vrste virusa. Torej nobena izmed verig ne tvori kovalentno zaključenega kroga. 5’ konci dsDNA se prekrivajo, kar je posledica reverzne transkripcije, saj se proces pravočasno ne ustavi. Sestavljena je iz 8 kb, kar se prepiše v 6 - 7 proteinov.  Ti so (na primeru cvetačnega mozaičnega virusa (CaMV)):
/>- Gibalni protein (MOV): sodeluje pri prenašanju virusa v sosednje celice preko plazmodezme.
- Transaktivator/viroplazmin (TAV): translacijski transaktivator, tvori vključitveno telesce, sodeluje pri reverzni transkripciji, sestavlja tubule za prenos virusa v sosednjo celico.
- Poliprotein (Pol): razstavi se na:  
  - aspartatno proteazo, ki sodeluje pri modifikaciji virusnih proteinov,
  - reverzno transkriptazo/RNAzo H, ki sodelujeta pri reverzni transkripciji.
- Kapsidni protein (CP): proteini, ki sestavljajo kapsido viriona, ima motiv Zn prsta, kar bi lahko omogočalo vezavo na nukleinske kisline.
- Z virionom povezan protein (VAP): polipeptid, ki se veže na nukleinske kisline, najdemo ga v vključitvenih telescih in virusnih delcih (brez C konca, ki omogoča vezavo na nukleinske kisline, sodeluje pri prenašanju virusa; esencialen za kužnost virusa).
- ATF (na uš prenašalni faktor): tvori vključitveno telesce, interagirajo z virusnimi delci in tubuli ter oblogo kutikule na sesalu uši – prenositveni faktor.
- Gibalni protein (MOV): sodeluje pri prenašanju virusa v sosednje celice preko plazmodezme.


== Replikacijski cikel ==
== Replikacijski cikel ==
Gostitelji hepadnavirusov so vretenčarji, kavlimovirusov pa rastline.
Gostitelji hepadnavirusov so vretenčarji, kavlimovirusov pa rastline.
'''Vstop v celico'''
=== Vstop v celico ===
Virus se najprej nespecifično veže na heparan sulfat proteoglikane na gostiteljski celici. Amino-terminalni konec preS1 je miristoiliziran in se veže na natrij tauroholatni kotransporter. Vstop v celico je lahko s pomočjo klatrina, kaveol ali pa je s mikropinocitozno odvisno endocitozo. Nato poteče zlivanje virusne in gostiteljske membrane v endosomu. Sprosti se nukleokapsida, ki preko interakcij z adaptorskimi proteini jedrnega pornega kompleksa vstopi v jedro.
Virus se najprej nespecifično veže na heparan sulfat proteoglikane na gostiteljski celici. Amino-terminalni konec preS1 je miristoiliziran in se veže na natrij tauroholatni kotransporter. Vstop v celico je lahko s pomočjo klatrina, kaveol ali pa je s mikropinocitozno odvisno endocitozo. Nato poteče zlivanje virusne in gostiteljske membrane v endosomu. Sprosti se nukleokapsida, ki preko interakcij z adaptorskimi proteini jedrnega pornega kompleksa vstopi v jedro.
Kavlimovirusi v celice vstopijo preko plazmodezme, povezave med rastlinskimi celicami, ali živalskega prenašalca, ki ga predstavljajo uši.
Kavlimovirusi v celice vstopijo preko plazmodezme, povezave med rastlinskimi celicami, ali živalskega prenašalca, ki ga predstavljajo uši.
'''Vstop v jedro'''
=== Vstop v jedro ===
Kapsida kavlimovirusov v citosolu ne razpade. V kapsidnih proteinih so našli motiv dveh Lys in dveh Arg, kar spominja na jedrni lokalizacijski signal (NLS) – bazične ak, ki je v nezrelih proteinih zakrita z N-koncem (prvih 76 kislih ak). Po vstopu virusa v celico se kapsida usede na jedrno membrano in z jedrno poro tvori interakcije, ki jih verjetno omogočajo importini ⍺ in ostali bližnji citoplazemski filamenti. Nato DNA po še ne poznanem postopku vstopi v jedro. Možno je, da ji pri vstopu pomagajo CP, saj imajo DNA vezavno domeno. Pri tem kapsida vsaj delno razpade, CP pa kljub NLS po večini ne vstopijo v jedro, kar je zanimiva regulacija.
Kapsida kavlimovirusov v citosolu ne razpade. V kapsidnih proteinih so našli motiv dveh Lys in dveh Arg, kar spominja na jedrni lokalizacijski signal (NLS) – bazične ak, ki je v nezrelih proteinih zakrita z N-koncem (prvih 76 kislih ak). Po vstopu virusa v celico se kapsida usede na jedrno membrano in z jedrno poro tvori interakcije, ki jih verjetno omogočajo importini ⍺ in ostali bližnji citoplazemski filamenti. Nato DNA po še ne poznanem postopku vstopi v jedro. Možno je, da ji pri vstopu pomagajo CP, saj imajo DNA vezavno domeno. Pri tem kapsida vsaj delno razpade, CP pa kljub NLS po večini ne vstopijo v jedro, kar je zanimiva regulacija.
Pretvorba v popolnoma zaključeno krožno molekulo DNA
===Pretvorba v popolnoma zaključeno krožno molekulo DNA ===
V jedru se virusni genom hepadnavirusov in kavlimovirusov pretvori v popolnoma zaključeno krožno molekulo DNA, ki služi kot matrica za vse virusne RNA. Proces popravljanja virusnega genoma vključuje:
V jedru se virusni genom hepadnavirusov in kavlimovirusov pretvori v popolnoma zaključeno krožno molekulo DNA, ki služi kot matrica za vse virusne RNA. Proces popravljanja virusnega genoma vključuje:<br
1. Dokončanje pozitivne verige.
/>1. Dokončanje pozitivne verige.<br
2. Odstranitev proteinskega primerja s 5' – konca negativne verige in RNA segmenta, pokritega s kapo, s pozitivne verige.
/>2. Odstranitev proteinskega ''primerja'' s 5' – konca negativne verige in RNA segmenta, pokritega s kapo, s pozitivne verige.<br
3. Ligacija obeh koncev verig.
/>3. Ligacija obeh koncev verig.
Podaljševanje verige, odstranitev primerjev in ligacija potečejo z gostiteljskimi encimi. Nastala DNA se organizira v strukturo podobno kromatinu, ki jo sestavlja DNA, histoni in nehistonski proteini.  
 
'''Transkripcija'''
Podaljševanje verige, odstranitev ''primerjev'' in ligacija potečejo z gostiteljskimi encimi. Nastala DNA se organizira v strukturo podobno kromatinu, ki jo sestavlja DNA, histoni in nehistonski proteini.  
=== Transkripcija ===
Virusi vsebujejo štiri prekrivajoče se bralne okvirje, ki so nastali z namenom, da se v genom zapiše čim več informacij. Med infekcijo nastanejo štirje glavni genomski mRNA transkripti, ki so heterogeni v velikosti in imajo enako polarnost.
Virusi vsebujejo štiri prekrivajoče se bralne okvirje, ki so nastali z namenom, da se v genom zapiše čim več informacij. Med infekcijo nastanejo štirje glavni genomski mRNA transkripti, ki so heterogeni v velikosti in imajo enako polarnost.
Odprti bralni okvirji:
Odprti bralni okvirji:<br
Pre-C RNA kodira jedrni protein C, protein ovojnice E in pregenomsko RNA.
/>- Pre-C RNA kodira jedrni protein C, protein ovojnice E in pregenomsko RNA.<br
Odprt bralni okvir P kodira multifunkcijski protein P.
/>- Odprt bralni okvir P kodira multifunkcijski protein P.<br
Pre-S RNA kodira tri površinske proteine.
/>- Pre-S RNA kodira tri površinske proteine.<br
RNA kodira majhen regulatorni protein X.
/>- RNA kodira majhen regulatorni protein X.
 
Gostiteljski transkripcijski faktorji (CCAAT/ojačevalni vezavni protein (C/EBP) in hepatocitni jedrni faktorji (HNF), virusni proteini (jedrni in X – protein) in ojačevalci (Enh1 in Enh2) regulirajo transkripcijo. Transkripcijski faktorji interagirajo s štirimi virusnimi promotorji – jedrni promotor, promotor S1, S2 in X.
Gostiteljski transkripcijski faktorji (CCAAT/ojačevalni vezavni protein (C/EBP) in hepatocitni jedrni faktorji (HNF), virusni proteini (jedrni in X – protein) in ojačevalci (Enh1 in Enh2) regulirajo transkripcijo. Transkripcijski faktorji interagirajo s štirimi virusnimi promotorji – jedrni promotor, promotor S1, S2 in X.
Procesiranje virusne RNA, transport v citosol in stabilizacija RNA so omogočeni z gostiteljskimi faktorji.
Procesiranje virusne RNA, transport v citosol in stabilizacija RNA so omogočeni z gostiteljskimi faktorji.
Pri transkripciji Kavlimovirusov se tvorita 35S in 19S RNA. 35S je prepis celotnega genoma z dodatnim odvečnim 180 nt dolgim poliadenilacijskim signalom, ki ga DNA polimeraza v prvem krogu transkripcije ignorira. Poliadenilacijsko mesto determinira konec translacije 13 nt nižje. Promotor te RNA je zelo raznolik, kar pomeni, da se nanj lahko veže veliko število ojačevalnih elementov, specifičnih za nek tip celice in prepoznajo neko določeno zaporedje ter virusu omogoča izražanje te RNA v vseh možnih tipih celic v različnih razvojnih stanjih. Našli so tudi alternativno spojene mRNA 35S, pri čemer se odstranijo določeni introni, ki jih predstavljajo določeni bralni okvirji. Pri tem postopku se tako eni bralni okvirji izrežejo in izločijo, se ne prevedejo.  
Pri transkripciji Kavlimovirusov se tvorita 35S in 19S RNA. 35S je prepis celotnega genoma z dodatnim odvečnim 180 nt dolgim poliadenilacijskim signalom, ki ga DNA polimeraza v prvem krogu transkripcije ignorira. Poliadenilacijsko mesto determinira konec translacije 13 nt nižje. Promotor te RNA je zelo raznolik, kar pomeni, da se nanj lahko veže veliko število ojačevalnih elementov, specifičnih za nek tip celice in prepoznajo neko določeno zaporedje ter virusu omogoča izražanje te RNA v vseh možnih tipih celic v različnih razvojnih stanjih. Našli so tudi alternativno spojene mRNA 35S, pri čemer se odstranijo določeni introni, ki jih predstavljajo določeni bralni okvirji. Pri tem postopku se tako eni bralni okvirji izrežejo in izločijo, se ne prevedejo.  
19S RNA pa pokriva le bralni okvir 4, kjer leži zapis za protein, ki tvori vključitveno telesce in deluje kot translacijski transaktivator.
19S RNA pa pokriva le bralni okvir 4, kjer leži zapis za protein, ki tvori vključitveno telesce in deluje kot translacijski transaktivator.
'''Translacija'''
=== Translacija ===
Za translacijo hepatitis B virusnih proteinov je značilen leaky scanning. To je pojav, ko se začetni kodon preskoči, translacija pa se tako začne na drugem AUG. Začetni kodon je lahko ACG, AUG ali ATG.
Za translacijo hepatitis B virusnih proteinov je značilen ''leaky scanning''. To je pojav, ko se začetni kodon preskoči, translacija pa se tako začne na drugem AUG. Začetni kodon je lahko AUG ali ACG.
 
Za Kavlimoviruse je značilen mehanizem ranžiranja za iniciacijo translacije, ki poteka pri translaciji 35S. Za ta mehanizem je značilno, da je iskanje iniciacijskega mesta translacije (AUG) diskontinuirno. Ribosom začne iskanje na 5' koncu, kamor je vezana kapa, nato pa čez nekaj časa naleti na oviro, ki jo po navadi predstavlja zanka, pri čemer ribosom razpade in se na mRNA ponovno veže za oviro, kjer išče iniciacijsko mesto translacije naprej. Preskoči večino vodilnega dela, da pride do daljših bralnih okvirjev.
Za Kavlimoviruse je značilen mehanizem ranžiranja za iniciacijo translacije, ki poteka pri translaciji 35S. Za ta mehanizem je značilno, da je iskanje iniciacijskega mesta translacije (AUG) diskontinuirno. Ribosom začne iskanje na 5' koncu, kamor je vezana kapa, nato pa čez nekaj časa naleti na oviro, ki jo po navadi predstavlja zanka, pri čemer ribosom razpade in se na mRNA ponovno veže za oviro, kjer išče iniciacijsko mesto translacije naprej. Preskoči večino vodilnega dela, da pride do daljših bralnih okvirjev.
Pri translaciji mRNA kavlimovirusov je pomemben še TAV, ki se prevede iz 19S mRNA in  omogoči boljšo translacijo 35S, verjetno deluje po mehanizmu ponovne iniciacije dolge policistronske 35S mRNA.
Pri translaciji mRNA kavlimovirusov je pomemben še TAV, ki se prevede iz 19S mRNA in  omogoči boljšo translacijo 35S, verjetno deluje po mehanizmu ponovne iniciacije dolge policistronske 35S mRNA.
Po translaciji poteka še procesiranje proteinov. CP proteinom se odstranita začetni in končni del verige, se metilirajo ter glikozilirajo. Pol protein se cepi na več funkcionalnih proteinov: aspartatno proteinazo in  reverzno transkriptazo/RNAzo H.
 
'''Pakiranje virusne nukleinske kisline v ovojnice'''
Po translaciji poteka še procesiranje proteinov. CP proteinom se odstranita začetni in končni del verige, se metilirajo ter glikozilirajo. Pol protein se cepi na več funkcionalnih proteinov: aspartatno proteazo in  reverzno transkriptazo/RNAzo H.
 
=== Pakiranje virusne nukleinske kisline v ovojnice ===
Virusni replikacijski sistem prepozna ε-lasnično zanko pregenomske RNA in jo spakira v kompleks RNA-protein skupaj s C in P proteini. ε-lasnična zanka se nahaja blizu 3'-konca nad poliadenilacijskim mestom. Polimerazni protein interagira z zanko in začne pakiranje v kapsido in reverzno transkripcijo pgRNA. C-terminalni konec polimeraze interagira z jedrnim proteinom za začetek pakiranja samo takrat, ko je polimeraza že vezana na zanko.
Virusni replikacijski sistem prepozna ε-lasnično zanko pregenomske RNA in jo spakira v kompleks RNA-protein skupaj s C in P proteini. ε-lasnična zanka se nahaja blizu 3'-konca nad poliadenilacijskim mestom. Polimerazni protein interagira z zanko in začne pakiranje v kapsido in reverzno transkripcijo pgRNA. C-terminalni konec polimeraze interagira z jedrnim proteinom za začetek pakiranja samo takrat, ko je polimeraza že vezana na zanko.
'''Reverzna transkripcija'''
=== Reverzna transkripcija ===
1. Reverzna transkriptaza se veže na 5' – ε lasnično zanko. Začetek sinteze je s kovalentno povezavo 1 nukleotida DNA verige na hidroksilno skupino Tyr ostanka reverzne transkriptaze.
1. Reverzna transkriptaza se veže na 5' – ε lasnično zanko. Začetek sinteze je s kovalentno povezavo 1 nukleotida DNA verige na hidroksilno skupino Tyr ostanka reverzne transkriptaze.<br
2. Reverzna transkriptaza sintetizira DNA, ki je komplementarna minus verigi RNA.
/>2. Reverzna transkriptaza sintetizira DNA, ki je komplementarna minus verigi RNA.<br
3. RNAzna aktivnost reverzne transkriptaze razgradi celo pgRNA, ki je hibridizirana DNA, razen primera DR-kape.
/>3. RNAzna aktivnost reverzne transkriptaze razgradi celo pgRNA, ki je hibridizirana DNA, razen primera DR-kape.<br
4. Primer DR-kapa se premakne na DR motiv
/>4. Primer DR-kapa se premakne na DR motiv.<br
5. Sinteza plus verige DNA se začne od DR2 do DR1 motiva.
/>5. Sinteza plus verige DNA se začne od DR2 do DR1 motiva.<br
6. Nova DNA veriga se premakne do DR1 zaporedja.
/>6. Nova DNA veriga se premakne do DR1 zaporedja.<br
7. Plus veriga DNA se podaljša. Tvori se sproščena krožna DNA. Sinteza DNA ni popolna, saj se virus prej izloči iz celice in zmanjka dNTP znotraj virusa.  
/>7. Plus veriga DNA se podaljša. Tvori se sproščena krožna DNA. Sinteza DNA ni popolna, saj se virus prej izloči iz celice in zmanjka dNTP znotraj virusa.  
 
Reverzna transkripcija Kavlimovirusov poteka v citoplazmi na TAV, ki s pomočjo še drugih proteinov tvori vključitveno telesce in sodeluje pri tvorbi kapside. tRNAMET predstavlja osnovo za sintezo (-) verige DNA iz RNA modela. RNAza H po reverzni transkripciji razgradi celo RNA razen oligo G delov, zato ostanejo vezani na DNA, kjer delujejo kot osnova za (+) verigo DNA. Sinteza obeh verig je prekomerna, kar rezultira v prekrivanju 5' koncev verig. Ti se v citoplazmi zaradi pomanjkanja popravljalnih eksonukleaz in ligaz ne morejo popraviti, zato je zapakirana v odprto krožno DNA.
Reverzna transkripcija Kavlimovirusov poteka v citoplazmi na TAV, ki s pomočjo še drugih proteinov tvori vključitveno telesce in sodeluje pri tvorbi kapside. tRNAMET predstavlja osnovo za sintezo (-) verige DNA iz RNA modela. RNAza H po reverzni transkripciji razgradi celo RNA razen oligo G delov, zato ostanejo vezani na DNA, kjer delujejo kot osnova za (+) verigo DNA. Sinteza obeh verig je prekomerna, kar rezultira v prekrivanju 5' koncev verig. Ti se v citoplazmi zaradi pomanjkanja popravljalnih eksonukleaz in ligaz ne morejo popraviti, zato je zapakirana v odprto krožno DNA.
'''Izstop iz celice in okužba drugih celic'''
=== Izstop iz celice in okužba drugih celic ===
Rastlinske celice imajo poleg plazmaleme še celično steno, zato je prehod v in iz celice težji. Virusi si tako pri premikanju iz celice v celico pomagajo z insekti in drugimi organizmi, ter plazmodezmami, ki jih razširijo. Za to potrebujejo prenašalne faktorje in gibalne proteine.
Rastlinske celice imajo poleg plazmaleme še celično steno, zato je prehod v in iz celice težji. Virusi si tako pri premikanju iz celice v celico pomagajo z insekti in drugimi organizmi, ter plazmodezmami, ki jih razširijo. Za to potrebujejo prenašalne faktorje in gibalne proteine.
== Viri ==
*Leclerc, D., Chapdelaine, Y., & Hohn, T. (1999). Nuclear Targeting of the Cauliflower Mosaic Virus Coat Protein. JOURNAL OF VIROLOGY, 73(1), 553–560.
*Acheson, N. H. Fundamentals of molecular virology. (John Wiley & Sons, 2011).
*Seeger, C. & Mason, W. S. Molecular Biology of Hepatitis B Virus Infection. doi:10.1016/j.virol.2015.02.031
*Hirth, L. (1986). The molecular biology of caulimoviruses. Microbiological Sciences, 3(9), 260–265. Retrieved from http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/3153587
[[Category:SEM]] [[Category:BMB]]

Latest revision as of 15:23, 22 April 2018

Biokemijske in molekularno biološke značilnosti

Struktura in sestavljanje ovojnice

Hepadnavirusi so majhni sferični virusni delci z ovojnico. V premeru merijo 40 nm. Virusna kapsida je ikozaedrične oblike. V nukleokapsidi vsebujejo zelo majhen genom, ki ga sestavlja 3 – 4 kb. Genom je delno dvoverižni in enoverižni DNA. Enoverižna regija je krajša, poljubne dolžine in je posledica prekinitve sinteze druge verige DNA z reverzno transkriptazo med zorenjem virusa. Dolžine posameznih verig se med predstavniki razlikujejo. Nobena od verig ne tvori kovalentno zaključenega kroga. Minus veriga se na svojem 5' – koncu povezuje s tirozinskim ostankom proteina P. Komplementarna plus veriga se povezuje na kratko RNA pokrito s kapo. Konca DNA se povezujeta z vodikovimi vezmi na dve ponavljajoči zaporedji (DR1 in DR2), kar omogoča krožno strukturo.
Genom v primeru hepatitis B virusa kodira sedem virusnih proteinov:
- Trije površinski glikoproteini: LS, MS in SS.
- Jedrni proteini: C, ki tvori nukleokapsido in E, ki ga najdemo med nukleokapsido in ovojnico.
- Polimeraza (reverzna transkiptaza): P, ki jo sestavlja več domen; N-terminalna domena, ki je primer na minus verigi DNA, domeno reverzne transkriptaze in ribonukleazno H domeno.
- Regulatorni protein: X, ki aktivira transkripcijo genov preko vezave na jedrne transkripcijske regulatorje.

Kavlimovirusi so edina znana skupina rastlinskih virusov z dvoverižno DNA (dsDNA) in nimajo lipidne ovojnice. Ikozaedrična kapsida je velika 50 nm in jo sestavlja 420 kapsidnih proteinov. Proteinska lupina je prekrita z VAP (z virionom povezani proteini). V proteinski lupini je krožna virusna DNA, ki vsebuje prekinitve enoverižnih delov dsDNA. Kje te prekinitve so in koliko jih je, je odvisno od posamezne vrste virusa. Torej nobena izmed verig ne tvori kovalentno zaključenega kroga. 5’ konci dsDNA se prekrivajo, kar je posledica reverzne transkripcije, saj se proces pravočasno ne ustavi. Sestavljena je iz 8 kb, kar se prepiše v 6 - 7 proteinov. Ti so (na primeru cvetačnega mozaičnega virusa (CaMV)):
- Transaktivator/viroplazmin (TAV): translacijski transaktivator, tvori vključitveno telesce, sodeluje pri reverzni transkripciji, sestavlja tubule za prenos virusa v sosednjo celico.
- Poliprotein (Pol): razstavi se na:
aspartatno proteazo, ki sodeluje pri modifikaciji virusnih proteinov,
reverzno transkriptazo/RNAzo H, ki sodelujeta pri reverzni transkripciji.
Kapsidni protein (CP): proteini, ki sestavljajo kapsido viriona, ima motiv Zn prsta, kar bi lahko omogočalo vezavo na nukleinske kisline.
- Z virionom povezan protein (VAP): polipeptid, ki se veže na nukleinske kisline, najdemo ga v vključitvenih telescih in virusnih delcih (brez C konca, ki omogoča vezavo na nukleinske kisline, sodeluje pri prenašanju virusa; esencialen za kužnost virusa).
- ATF (na uš prenašalni faktor): tvori vključitveno telesce, interagirajo z virusnimi delci in tubuli ter oblogo kutikule na sesalu uši – prenositveni faktor.
- Gibalni protein (MOV): sodeluje pri prenašanju virusa v sosednje celice preko plazmodezme.

Replikacijski cikel

Gostitelji hepadnavirusov so vretenčarji, kavlimovirusov pa rastline.

Vstop v celico

Virus se najprej nespecifično veže na heparan sulfat proteoglikane na gostiteljski celici. Amino-terminalni konec preS1 je miristoiliziran in se veže na natrij tauroholatni kotransporter. Vstop v celico je lahko s pomočjo klatrina, kaveol ali pa je s mikropinocitozno odvisno endocitozo. Nato poteče zlivanje virusne in gostiteljske membrane v endosomu. Sprosti se nukleokapsida, ki preko interakcij z adaptorskimi proteini jedrnega pornega kompleksa vstopi v jedro.

Kavlimovirusi v celice vstopijo preko plazmodezme, povezave med rastlinskimi celicami, ali živalskega prenašalca, ki ga predstavljajo uši.

Vstop v jedro

Kapsida kavlimovirusov v citosolu ne razpade. V kapsidnih proteinih so našli motiv dveh Lys in dveh Arg, kar spominja na jedrni lokalizacijski signal (NLS) – bazične ak, ki je v nezrelih proteinih zakrita z N-koncem (prvih 76 kislih ak). Po vstopu virusa v celico se kapsida usede na jedrno membrano in z jedrno poro tvori interakcije, ki jih verjetno omogočajo importini ⍺ in ostali bližnji citoplazemski filamenti. Nato DNA po še ne poznanem postopku vstopi v jedro. Možno je, da ji pri vstopu pomagajo CP, saj imajo DNA vezavno domeno. Pri tem kapsida vsaj delno razpade, CP pa kljub NLS po večini ne vstopijo v jedro, kar je zanimiva regulacija.

Pretvorba v popolnoma zaključeno krožno molekulo DNA

V jedru se virusni genom hepadnavirusov in kavlimovirusov pretvori v popolnoma zaključeno krožno molekulo DNA, ki služi kot matrica za vse virusne RNA. Proces popravljanja virusnega genoma vključuje:
1. Dokončanje pozitivne verige.
2. Odstranitev proteinskega primerja s 5' – konca negativne verige in RNA segmenta, pokritega s kapo, s pozitivne verige.
3. Ligacija obeh koncev verig.

Podaljševanje verige, odstranitev primerjev in ligacija potečejo z gostiteljskimi encimi. Nastala DNA se organizira v strukturo podobno kromatinu, ki jo sestavlja DNA, histoni in nehistonski proteini.

Transkripcija

Virusi vsebujejo štiri prekrivajoče se bralne okvirje, ki so nastali z namenom, da se v genom zapiše čim več informacij. Med infekcijo nastanejo štirje glavni genomski mRNA transkripti, ki so heterogeni v velikosti in imajo enako polarnost. Odprti bralni okvirji:
- Pre-C RNA kodira jedrni protein C, protein ovojnice E in pregenomsko RNA.
- Odprt bralni okvir P kodira multifunkcijski protein P.
- Pre-S RNA kodira tri površinske proteine.
- RNA kodira majhen regulatorni protein X.

Gostiteljski transkripcijski faktorji (CCAAT/ojačevalni vezavni protein (C/EBP) in hepatocitni jedrni faktorji (HNF), virusni proteini (jedrni in X – protein) in ojačevalci (Enh1 in Enh2) regulirajo transkripcijo. Transkripcijski faktorji interagirajo s štirimi virusnimi promotorji – jedrni promotor, promotor S1, S2 in X.

Procesiranje virusne RNA, transport v citosol in stabilizacija RNA so omogočeni z gostiteljskimi faktorji.

Pri transkripciji Kavlimovirusov se tvorita 35S in 19S RNA. 35S je prepis celotnega genoma z dodatnim odvečnim 180 nt dolgim poliadenilacijskim signalom, ki ga DNA polimeraza v prvem krogu transkripcije ignorira. Poliadenilacijsko mesto determinira konec translacije 13 nt nižje. Promotor te RNA je zelo raznolik, kar pomeni, da se nanj lahko veže veliko število ojačevalnih elementov, specifičnih za nek tip celice in prepoznajo neko določeno zaporedje ter virusu omogoča izražanje te RNA v vseh možnih tipih celic v različnih razvojnih stanjih. Našli so tudi alternativno spojene mRNA 35S, pri čemer se odstranijo določeni introni, ki jih predstavljajo določeni bralni okvirji. Pri tem postopku se tako eni bralni okvirji izrežejo in izločijo, se ne prevedejo.

19S RNA pa pokriva le bralni okvir 4, kjer leži zapis za protein, ki tvori vključitveno telesce in deluje kot translacijski transaktivator.

Translacija

Za translacijo hepatitis B virusnih proteinov je značilen leaky scanning. To je pojav, ko se začetni kodon preskoči, translacija pa se tako začne na drugem AUG. Začetni kodon je lahko AUG ali ACG.

Za Kavlimoviruse je značilen mehanizem ranžiranja za iniciacijo translacije, ki poteka pri translaciji 35S. Za ta mehanizem je značilno, da je iskanje iniciacijskega mesta translacije (AUG) diskontinuirno. Ribosom začne iskanje na 5' koncu, kamor je vezana kapa, nato pa čez nekaj časa naleti na oviro, ki jo po navadi predstavlja zanka, pri čemer ribosom razpade in se na mRNA ponovno veže za oviro, kjer išče iniciacijsko mesto translacije naprej. Preskoči večino vodilnega dela, da pride do daljših bralnih okvirjev.

Pri translaciji mRNA kavlimovirusov je pomemben še TAV, ki se prevede iz 19S mRNA in omogoči boljšo translacijo 35S, verjetno deluje po mehanizmu ponovne iniciacije dolge policistronske 35S mRNA.

Po translaciji poteka še procesiranje proteinov. CP proteinom se odstranita začetni in končni del verige, se metilirajo ter glikozilirajo. Pol protein se cepi na več funkcionalnih proteinov: aspartatno proteazo in reverzno transkriptazo/RNAzo H.

Pakiranje virusne nukleinske kisline v ovojnice

Virusni replikacijski sistem prepozna ε-lasnično zanko pregenomske RNA in jo spakira v kompleks RNA-protein skupaj s C in P proteini. ε-lasnična zanka se nahaja blizu 3'-konca nad poliadenilacijskim mestom. Polimerazni protein interagira z zanko in začne pakiranje v kapsido in reverzno transkripcijo pgRNA. C-terminalni konec polimeraze interagira z jedrnim proteinom za začetek pakiranja samo takrat, ko je polimeraza že vezana na zanko.

Reverzna transkripcija

1. Reverzna transkriptaza se veže na 5' – ε lasnično zanko. Začetek sinteze je s kovalentno povezavo 1 nukleotida DNA verige na hidroksilno skupino Tyr ostanka reverzne transkriptaze.
2. Reverzna transkriptaza sintetizira DNA, ki je komplementarna minus verigi RNA.
3. RNAzna aktivnost reverzne transkriptaze razgradi celo pgRNA, ki je hibridizirana DNA, razen primera DR-kape.
4. Primer DR-kapa se premakne na DR motiv.
5. Sinteza plus verige DNA se začne od DR2 do DR1 motiva.
6. Nova DNA veriga se premakne do DR1 zaporedja.
7. Plus veriga DNA se podaljša. Tvori se sproščena krožna DNA. Sinteza DNA ni popolna, saj se virus prej izloči iz celice in zmanjka dNTP znotraj virusa.

Reverzna transkripcija Kavlimovirusov poteka v citoplazmi na TAV, ki s pomočjo še drugih proteinov tvori vključitveno telesce in sodeluje pri tvorbi kapside. tRNAMET predstavlja osnovo za sintezo (-) verige DNA iz RNA modela. RNAza H po reverzni transkripciji razgradi celo RNA razen oligo G delov, zato ostanejo vezani na DNA, kjer delujejo kot osnova za (+) verigo DNA. Sinteza obeh verig je prekomerna, kar rezultira v prekrivanju 5' koncev verig. Ti se v citoplazmi zaradi pomanjkanja popravljalnih eksonukleaz in ligaz ne morejo popraviti, zato je zapakirana v odprto krožno DNA.

Izstop iz celice in okužba drugih celic

Rastlinske celice imajo poleg plazmaleme še celično steno, zato je prehod v in iz celice težji. Virusi si tako pri premikanju iz celice v celico pomagajo z insekti in drugimi organizmi, ter plazmodezmami, ki jih razširijo. Za to potrebujejo prenašalne faktorje in gibalne proteine.

Viri

  • Leclerc, D., Chapdelaine, Y., & Hohn, T. (1999). Nuclear Targeting of the Cauliflower Mosaic Virus Coat Protein. JOURNAL OF VIROLOGY, 73(1), 553–560.
  • Acheson, N. H. Fundamentals of molecular virology. (John Wiley & Sons, 2011).
  • Seeger, C. & Mason, W. S. Molecular Biology of Hepatitis B Virus Infection. doi:10.1016/j.virol.2015.02.031
  • Hirth, L. (1986). The molecular biology of caulimoviruses. Microbiological Sciences, 3(9), 260–265. Retrieved from http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/3153587