View source for Hipersensitiven genetsko kodiran fluorescenčni indikator (roGFP2-Prx1) za kontinuirno merjenje znotrajceličnega H2O2 med mikro-kultivacijo celic

Izhodiščni članek:[https://bio-protocol.org/e4317  V. Gast, V. Siewers, M. Molin: A Hypersensitive Genetically Encoded Fluorescent Indicator (RoGFP2-Prx1) Enables Continuous Measurement of Intracellular H2O2 during Cell Micro-Cultivation. Bio Protoc. 2022, 12, 1–12.]
==Uvod ==
Saccharomyces cerevisiae je zelo pogosto uporabljena kvasovka v industriji, pogosto pa se jo uporablja tudi kot modelni organizem za namen proučevanja evkariontske celične biologije. In za slednji namen je bila uporabljena tudi v tem članku, ko so proučevali nastajanje in kopičenje znotrajceličnega H2O2. [1]
Dokazano je bilo, da v primeru izražanja velike količine rekombinantnih proteinov (npr. v biofarmacevtski industriji) vpliva na metabolizem celice, v kateri se protein izraža. To v kombinaciji s pogoji v bioreaktorju (prisotnost hidrodinamske sile in nehomogenost) lahko povzroča stresne pogoje v celicah. Celica se na visoko raven izražanja rekombinantnih pogojev prilagodi s povečanjem proizvodnje energije, to pa lahko vodi do porasta nastajanja reaktivnih kisikovih zvrsti (ROS). Kopičenje znotraj celičnih ROS lahko moti celično aktivnost [2]. ROS nastajajo pri nepopolni redukciji kisika v vodo, ena izmed takih zvrsti je tudi H2O2. V evkariontskih celicah večina H2O2 nastaja v mitohondrijih, poleg tega pa je pomemben vir H2O2 tudi proizvodnja sekretornih proteinov. H2O2 se v tem primeru tvori kot posledica tvorjenja in razpadanja disulfidnih vezi pri proteinih, še preden te zavzamejo končno obliko. To se dogaja tudi pri proizvodnji rekombinantnih proteinov, kjer je cilj proizvodnja velike količine sekretornih proteinov. Povečana tvorba sekretonih proteinov tako lahko povzroči povišano proizvodnjo H2O2 in s tem potencialni oksidativni stres.  [1]
Protein kinaza Gcn2 pa je lahko aktiviran tudi ob dodatku H2O2 v medij. Gcn2 pri Saccharomyces cerevisiae ima pomembno vlogo pri aminokislinskem stradanju. Molekula tRNA, ki ne vsebuje aminokisline aktivira Gcn2, ki nato fosforilira translacijski indikacijski faktor eIF2a, kar vodi v zmanjšanje iniciacije translacije [3]. 
V preteklosti so za merjenje reaktivnih kisikovih zvrsti (ROS) uporabljali različna ROS-občutljiva barvila. Taka barvila so nedefinirano specifična in imajo slabo ločljivost tako prostorsko kot časovno. Nova tehnologija, z genetsko kodiranimi fluorescenčni indikatorji (GEFI), pa omenjenih pomanjkljivosti nimajo. GEFI so fluorescenčni biosenzorji, ki omogočajo spremljanje celičnih procesov v realnem času, med drugim tudi  spremljanje spojin kot je H2O2.   Zaradi metod merjenja in zaznavanja H2O2 je proučevaje teh procesov precej zapleteno. Sicer pa je dostopnih vse več genetsko kodiranih fluorescenčnih indikatorjev (GEFIs), ki lahko specifično zaznavajo nizke koncentracije znotrajceličnega vodikovega peroksida. V tem članku so uporabili GEFI senzor, ki je sestavljen iz dveh fuzijskih proteinov; prvi jeH2O2- reaktiven perokisredoksin (npr. pri kvasovkah Prx1), drugi fuzijski protein pa je roGFP (zeleni fluorescenčni protein).  [1]. 
==Rezultati==
V članku je predstavljen protokol uporabe senzorja roGFP2-Prx1 in vivo za merjenje citosolnega H2O2 med kontinuirno mikro-kultivacijo Saccharomyces cerevisiae v BioLectorju (Mp2 Labs). Protokol je bil uspešno uporabljen za detekcijo sprememb na ravni citosolnega H2O2 v Saccharomyces cerevisiae, ki nastaja zaradi proizvajanja rekombinantnih proteinov. Pričakovano je, da bi bil senzor uporaben tudi za merjenje H2O2 iz drugih virov, ne le zgolj pri proizvodnji rekombinantih proteinov [1]. 
Zanimala jih je tudi raven protein kinaze Gcn2 pri proizvodnji rekombinantnega proteina. Zato so v študiji preučevali ali kinazo Gcn2 lahko aktivira tudi endogeni H2O2, ki nastaja pri proizvodnji rekombinantnih proteinov in ali bi odstranitev kinaze vplivala na citosolni H2O2 ter na učinkovitost proizvodnje rekombinantnih proteinov [1]. 
===Genetsko kodirani fluorescenčni indikator roGFP-Prx1===
Osnova za specifičnost GEFI senzorja, ki so ga uporabili v tem protokolu, dosežejo z uporabo dveh fuzijskih proteinov, ki skupaj tvorita redoks par. Eden od fuzijskih proteinov je H2O2- reaktivna perokisredoksin (npr. pri kvasovkah Prx1), drugi fuzijski protein pa je roGFP (zeleni fluorescenčni protein). roGFP2 je izboljšan GFP, ima dve cisteina v neposredni bližini kromofora. Ob nastajanju ali razpadanju disulfidnih vezi med omenjenima cisteinoma pride do spremembe protonacijskega stanja kromofora, kar spremeni valovno dolžino vzbujanja. Pri reakciji H2O2 dva cisteina na Prx1 tvorita disulfidno vez, ki nato reagira z cisteini na roGFP2 ter tvori mešano disulfidno vez.  Tvorba te notranje disulfdne vezi med Prx1 in roGFP2 je razlog za spremembo valovne dolžine vzbujanja. Vrh vzbujanja za roGFP2 je pri 488 nm v reducirani obliki, v oksidirani obliki pa je vrh vzbujanjapri 400 nm.  Funkcionalnost in občutljivost senzorjev v celicah so testirali z dodajanjem endogenega H2O2 in reducirnega sredstva (DTT) v medij. Senzor roGFP-Prx1 zaznava tako reduktivne kot oksidativne spremembe v zunajceličnem okolju [1].  
===Priprava sevov Saccharomyces cerevisiae z roGFP-Prx1===
Pri eksperimentu so uporabili Saccharomyces cerevisiae sev B184ura3∆ in plazmida pRS416-TEF1-roGFP2-PRX1 ter kontrolni plazmid pRS416M1-TEF1. Kontroli plazmid je bil skonstruiran tako, da so mu odstranili vsa restrikcijska mesta razen BamHI in EcoRI. Navedene plazmide so s transformacijo vnesli Saccharomyces cerevisiae. Tako pripravljene celice so gojili na minimalnem gojišču brez uracila (SD-URA agar plošče) [1]. 
Mikro-kultivacijo so izvajali v  BioLector I (Mp2 Labs). BioLectore je sistem, ki temelji na standardnem formatu mikrotitrskih plošč z 48 vdolbinicami, ki pa hkrati omogoča merjenje različnih parametrov, med katerimi je tudi  fluorescenca molekul. Ta sistem je omogočil spremljanje stanja v realnem času [4].  
===Določanje vrednosti znotrajceličnega H2O2===
Analizirali so podatke štirih vzorčenih sevov Saccharomyces cerevisiae:
*B184 (zapis za  rekombinantni protein amilazo in vsebuje gen za Gcn2)
*B184 gcn2∆ (zapis za rekombnantni protein amilazo in ne vsebuje gena za Gcn2)
*B184 kontrolni plazmid (ne vsebuje zapisa za rekombinantni protein in vsebuje gen za Gcn2)
*B184 gcn2∆ kontrolni plazmid (ne vsebuje zapisa za rekombinantni protein in ne vsebuje gena za Gcn2)
Za analizo so bili uporabljeni podatki, kjer je bilo pri UV-GFP in GFP povečanje vsaj za 100 in pri OD620 povečanje vsaj za 20. Podali so grafe za OD620, UV-GFP in GFP v odvisnosti od časa, na katerih so med seboj primerjali podatke za zgoraj navedene seve [1]. 
Fluorescenca izmerjena pri sevu s kontrolnim plazmidom ustreza avtoflurescenci posameznega plazmida. Zato je te vrednosti potrebno odšteti od vrednosti izmerjenih pri sevih, ki vsebujejo plazmid, ki nosi zapis za senzor. Nato pa določimo razmerje Ox/Red. Maksimum vzbujanja roGFP2 v reducirani obliki je pri 488 nm, v oksidirani obliki pa je maksimum vzbujanja roGFP2 pri 400 nm. Razmerje Ox/red dobimo z deljenjem signala pri 400 nm z signalom pri 488 nm. V nestresnih pogojih endogeni H2O2 na bazalni ravni je to razmerje blizu ena [1]. 
Sev, ki vsebuje zapis za rekombinantni protein (amilazo) in hkrati vsebuje gen za protein kinazo Gcn2 je imel skozi celoten čas gojenja razmerje Ox/Red višje kot kontrolni sev, ki je vseboval gen za protein kinazo Gcn2, ni pa vseboval zapisa za rekombinantni protein. To nakazuje na višjo raven H2O2 v citosolu, ki je nastajal kot posledica izražanja rekombinantnega proteina [1]. 
Sev, ki so vsebovali gen za protein kinazo Gcn2 so primerjali s setom sevov, ki nista vsebovala zapisa za ta gen. Eden izmed teh dveh sevov je vseboval zapis za rekombinanti protein (amilazo), drugi sev pa je bil kontroli in zapisa za rekombinantni protein ni vseboval. Odstranitev gena za protein kinazo Gcn2 je vodila do zmanjšanja vsebnosti citosolnega H2O2 v sevu, ki proizvaja rekombinantni protein, kljub temu da je bilo v tem primeru izraženo dvakrat več proteina kot pri sevu, ki je vseboval gen za Gcn2. Pri kontrolnih sevih, ki nimata zapisa za rekombinantni protein pa prisotnost oziroma odsotnost gena za protein kinazo Gcn2, ni bilo bistvene razlike v razmerju Ox/Red [1]. 
==Zaključek ==
Indikator roGFP2-Prx1, se uporablja za določanje znotrajceličnega H2O2, ki nastaja kot posledica izražanja rekombinantnih proteinov oziroma drugih dejavnikov v celici, ki povzročajo nastajanje ROS. V primerjavi z ROS-občutljivimi barvili, ki so jih uporabljali v preteklosti, omogočajo genetsko kodiranih fluorescenčnih indikatorjev (GEFI) natančnejše, relativno hitro in ob enem tudi enostavnejše  spremljanje procesov v realnem času. V članku je opisan protokol za uporabo indikatorja roGFP-Prx1 v kvasovki Saccharomyces cerevisiae. Ugotavljali pa so tudi kakšen je vpliv prisotnosti gena za protein, kinazo Gcn2. Za tega se je izkazalo, da odsotnost tega gena povzroči nižjo raven citosolnega H2O2. 
==Literatura ==
[1]	V. Gast, V. Siewers, M. Molin: A Hypersensitive Genetically Encoded Fluorescent Indicator (RoGFP2-Prx1) Enables Continuous Measurement of Intracellular H2O2 during Cell Micro-Cultivation. Bio Protoc. 2022, 12, 1–12.

[2]	V. Chevallier, M. R. Andersen, L. Malphettes: Oxidative Stress-Alleviating Strategies to Improve Recombinant Protein Production in CHO Cells. Biotechnol. Bioeng. 2018, 117, 1172–1186.

[3]	B. A. Castilho, R. Shanmugam, R. C. Silva, R. Ramesh, B. M. Himme, E. Sattlegger: Keeping the EIF2 Alpha Kinase Gcn2 in Check. Biochim. Biophys. Acta - Mol. Cell Res. 2014, 1843, 1948–1968.

[4]	Biolector. Mp2 Labs. https://www.m2p-labs.com/bioreactors/biolector-modules/. (dostop: 5.5.2022)