Izboljšava cepiv proti antraksu z uporabo iz virusnih replikonov izvedenih vektorjev, ki omogočajo izražanje zaščitnega antigena.

From Wiki FKKT

Revision as of 19:25, 6 May 2015 by Daša Pavc (Talk | contribs)
(diff) ←Older revision | Current revision (diff) | Newer revision→ (diff)
Jump to: navigation, search

UVOD


Za raziskavo možnosti izboljšanja cepiva proti antraksu pri ljudeh so se znanstveniki odločili, kljub temu, da je človeku nevarna oblika redka v naravi, zaradi visoke smrtnosti in enostavnega širjenja spor ter trdoživosti B. anthracis. Trenutno licenčno cepivo proti antraksu v ZDA je osnovano na zaščitnem antigenu antraksa (PA protective antigen), katerega slabi lastnosti sta, da je zelo reaktogeno ter da je potrebnih več odmerkov cepiva (6x cepljenje). PA ima glavno vlogo pri nastanku toksinov in je tako najpomembnejša komponenta antraks toksina. PA je sestavljen iz 4 domen, med katerimi je za vezavo antraks toksina na receptorje pomembna domena PA4, zato predvidevajo, da je PA4 ključni antigen pri ojačitvi imunskega odgovora, na s cepivom povzročeno okužbo z antraksom. Trenutne so raziskave na tem področju usmerjene v pridobivanje cepiv, ki vsebujejo rekombinantni PA ali pa DNA cepiva z novimi adjuvansi ali dostavnimi sistemi. DNA cepiva na živalskih modelih dokazano izzovejo humoralni in celični imunski odgovor, potreben je le razvoj cepiva ki bi ga lahko uporabili na ljudeh. V študiji so testirali imunogenost in izboljšanje učinkovitosti konvencionalnih nevirulentnih DNA cepiv ter virulentnih DNA cepiv, ki so vsebovala virusni replikon iz Semliki forest virus (SFV). Imunogenost in povečanju učinkovitosti DNA cepiv so primerjali tudi s SFV VRP (viral replicon particle) cepivi.

METODE IN REZULTATI


Pripravili so 8 rekombinantnih DNA plazmidov (4 nevirulenti plazmidi in 4 virulentni SFV replikonski plazmidi). Konstrukti so izražali PA ali PA4 antigen, ter so vsebovali signalno zaporedje ali pa le tega ni bilo. Poleg tega so pripravili SFV VRP s kotransfekcijo BHK-21 celic s predhodnje pripravljenimi SFV vektorji in pomožnim virusnim vektorjem. Povečanje učinkovitosti in imunogenost cepiv so testirali na miših Balb/c ki so jih imunizirali s DNA ali VRP cepivi, kot negativno kontorolo pa so uporabili DNA in VRP cepiva, katerih vektorji niso vsebovali vključka za PA ali PA4 antigen. Imunogenost cepiv so preverili s testiranjem seruma imuniziranih miši z ELISA testom. Določili so tudi IgG titer ter titer razmerja izotipov IgG1/IgG2a. Učinkovitost protiteles proti PA so določili s TNA testom. Z ELISA testom so določili tudi raven citokinov IL-4 in IFN- γ. Pri primerjavi 8 DNA cepiv so ugotovili, da vsa DNA cepiva, ki vsebujejo zaporedje za izražanje PA izzovejo močnejši humoralni in celično posredovan imunski odgovor kot DNA cepiva, ki si vsebovala zaporedje za PA4. Močnejši PA specifični imunski odgovor sprožijo SFV replikonska DNA cepiva v primerjavi z nevirulentnimi DNA cepivi. Prisotnost oziroma odsotnost signalne sekvence ni imela vpliva na učinkovitost DNA cepiv. Opazili so še, da vsa DNA cepiva sprožijo prednostno s Th2 celicami posredovan humoralni imunski odgovor. Po imunizaciji miši z DNA cepivi so ugotovili, da so ustrezno zaščito prejele samo miši cepljene z DNA cepivi s SFV replikoni, ki so izražali PA antigen z ali brez signalnega zaporedja, medtem ko so miši izpostavljene ostalim DNA cepivom ter negativni kontroli poginile. Po izpostavitvi miši večji količini cepiva so dobili enake rezultate. Preučili so tudi vpliv SFV VRP cepiv, pri čemer so ugotovili, da VRP cepiva, ki vsebujejo zaporedje za PA sprožijo močnejši PA specifični imunski odziv kot cepiva, ki so vsebovala zaporedje za PA4. Vsa VRP cepiva prednostno izzovejo s Th2 celicami posredovan humoralni imunski odziv ne glede na prisotnost signalnih zaporedij. Cepiva VRP, ki so vsebovala zaporedje za izražanje PA so imuniziranim mišim nudila popolno zaščito, medtem ko so cepiva, ki so vsebovala zaporedje za PA4 imuniziranim mišim nudila le delno zaščito.

ZAKLJUČEK


Rezultati študije kažejo, da DNA cepiva z SFV replikoni in VRP cepiva izzovejo močnejši PA specifični imunski odgovor kot konvencionalna nevirulentna DNA cepiva, ter imuniziranim mišim nudijo učinkovito zaščito. SFV replikonska DNA cepiva izzovejo poleg humoralnega tudi celično posredovani imunski odgovor, kar je dobro za doseganje optimalne imunosti. Cilj raziskave in tudi prihodnjih raziskav je konstrukcija DNA vektorja, ki bo izražal velike količine antigena in bo sposoben sprožiti močan imunski odziv. DNA cepiva s SFV replikoni so učinkovita, poleg tega ne zahtevajo velikih odmerkov kot konvencionalna nevirulentna DNA cepiva, zato so potencialni kandidati za klinične aplikacije, vendar so pri samem postopku izdelave vektorjev potrebne še številne optimizacije. Nadaljnje študije bodo usmerjene v raziskave učinkov cepiva na nečloveških primatih z drugimi dostavnimi sistemi, pri tem upajo, da jim bo to pripomoglo pri uporabi cepiva na človeka.

Personal tools