Kaskadno ojačano genetsko vezje za detekcijo glivnih patogenov

Izhodiščni članek: Cascaded amplifying circuit enables sensitive detection of fungal pathogens

Uvod

Detekcija glivnih antigenov je pomembna tako v medicinski diagnostiki kot tudi pri analizi okoljskih vzorcev in preverjanju kvalitete hrane. Konvencionalne mikrobiološke metode so navadno počasne in vključujejo veliko mehanizacije. Alternativo predstavljajo biosenzorji, ki naj bi omogočali lažjo, natančno in hitro detekcijo antigenov v različnih okoljih. Primeren organizem za takšno genetsko vezje je gliva, ki nam je dobro poznana – Saccharomyces cerevisiae. V kvasovkah S. cerevisiae je najbolje poznana signalizacija preko z G-proteinom povezanega receptorja (GPCR), ki transducira signale glivnih feromonov za regulacijo procesov parjenja kvasovk in je ena najbolj raziskanih signalnih poti pri evkariontih. Signalna pot GPCR v kvasovkah je primerna za uporabo v biosenzorju. V zadnjih letih je mogoče opaziti trend porasti kvasnih biosenzorjev, ki temeljijo na GPCR, za zaznavo različnih molekul od kemikalij (THC) do DNA. Pogosta težava, ki se pojavlja pri zaznavi tarčnih molekul, je šibek izhodni signal, ki ga težko ločimo od šuma. V izhodiščnem članku so C. Fan in sod. predstavili alternativo genetsko vezje, ki združi signalno pot GPCR z galaktoznim regulonom in v celici S. cerevisiae omogoča zaznavanje človeku nevarne priložnostne patogene glive Candide albicans. Ta gliva je pogost vzrok za sistemske mikoze pri pacientih z imunskimi pomanjkljivostmi. Zaznava temelji na prisotnosti feromonskega peptida C. albicans (faktor Ca).1,2

Osnove genetskega vezja

Genetsko vezje sestavlja signalna pot GPCR, ki je povezana z galaktoznim regulonom preko sintetičnega transkripcijskega faktorja (sTF). Z uporabo galaktoznega sistema se izognemo kompleksni regulaciji sistema deljenja kvasovk, s katerim je GPCR signalna pot povezana, z uporabo sTF pa negativni regulaciji, ki jo ima transkripcijski faktor Ste12. Vezje so dodatno opremili s pozitivno povratno zanko, ki izboljša občutljivost biosenzorja. Uspešnost biosenzorja in kinetične lastnosti transdukcije so preverjali z uporabo ojačanega zelenega fluorescenčnega proteina (EGFP), katerega izražanje je bilo regulirano z galaktoznim regulonom. Z dvema galaktoznima promotorjema (Pgal10 in Pgal1) je reguliran betaksantinski reporterski sistem dveh genov (BvCYP76AD5 in MjDOD), ki ob dovolj veliki koncentraciji faktorja Ca katalizirata nastanek betaksantinov. Betaksantinski reporterski sistem naj bi omogočal zaznavo s prostim očesom, saj ne temelji na fluorescenci, ampak na obarvanju in je tako primeren za enostavno uporabo na terenu. Za pripravo biosenzorjev so uporabili sev S. cerevisiae PK2-1C in njegove izpeljanke, kloniranje pa so izvedli v bakterijskih celicah E. coli.1,2

Signalna pot GPCR

Signalno pot GPCR je mogoče racionalizirati in minimizirati na osnovne elemente signalne poti GPCR. Ključni za prenos feromonskega signala so proteini Ste2 (α-faktor GPCR), Gpa1, Ste4 in Ste18 (α,β in γ podenote G-proteina), Ste5, 7, 11, 20 in Fus3 (MAPK) ter Ste12 (transkripcijski faktor), ki je povezan z aktivacijo od feromonov odvisnega promotorja pFUS1. Osrčje te signalne poti je MAPK kaskadna pot, ki ostane nespremenjena, okoli nje pa so W. M. Shaw in sod. ustvarili minimalno efektivno signalizacijsko pot preko GPCR. Eksperiment so opravili tako in vivo kot in silico. Ustvarili so modelno sinteznobiološko vezje, ki so ga C. Fan in sod. prenovili in uporabili pri sintezi biosenzorja za faktor Ca.1,3

Rezultati in diskusija

1. generacija

C. Fan in sod. so za idejo priprave biosenzorja signalno pot korenito spremenili in spremljali vplive sprememb na končno izražanje. Zamenjali so promotor pFUS1 s Pgal in galaktozni regulon povezali s sTF, ki ima DNA vezavno domeno proteina GAL4 in aktivacijsko domeno Ste12, ki je odvisna od prisotnosti feromonov. Da bi biosenzor specifično zaznal faktor Ca so omogočili z izražanjem heterolognega receptorja Ste2 iz C. albicans (Ca Ste2) v kvasnih celicah, kar bi teoretično lahko naredili tudi za druge vrste patogenih gliv. Celice, ki so izražale sTF so pripravili s CRISPR/Cas9 tehnologijo, s katero so zamenjali DNA vezavno domeno Ste12 za GAL4. Ključno je bilo tudi, da so kvasne celice izražale Ca Ste2, ki se je nahajal na plazmidu pod kontrolo promotorja TEF2, in vsebovale reporterski plazmid. Sev, ki so ga pripravili, so poimenovali Sc-G1.0-Ca. Sev, v katerem so pripravljali primarni biosenzor, je že imel delecije Δste2, Δfar1, Δgal80 in Δgal4. Da bi preverili, ali je implementacija sTF in galaktoznega regulona smiselna, so biosenzor sklopili z reporterskim sistemom na osnovi ojačenega zelenega fluorescenčnega proteina (EGFP) in primerjali fluorescenco ob dodajanju faktorja Ca s sistemom, ki je imel EGFP pod kontrolo pFUS1 in transkripcijski faktor Ste12, torej klasični sistem zaznavanja feromonov. Fluorescenco EGFP v odvisnosti od koncentracije faktorja Ca so spremljali s Hillovo funkcijo; opazovali so parametre Hillove konstante Kc, ki nam opiše polovico maksimalne efektivne koncentracije faktorja Ca in maksimum izražanja (k). Kc opiše polovično efektivno koncentracijo. Meja zaznavanja (LOD) faktorja Ca se je z uporabo sTF in Pgal znižala iz 1nM na 0,1 nM, Kc iz 23 nM na 4,5 nM, k pa se je zvišal.1

2. generacija

Sst2 je protein, ki negativno regulira Gpa1 s stimuliranjem hidrolize GTP. Že W. M. Shaw in sod. so določili, da bi inhibicija Sst2 najverjetneje promovirala aktivnost GPCR signalne poti. V genomu kvasovke so v izhodiščnem članku izvedli dodatno mutacijo Δsst2 in ta sev poimenovali kot drugo generacijo biosenzorja Sc-G2.0-Ca. LOD se je v primerjavi z Sc-G1.0-Ca zmanjšal na 10 pM. V primerjavi s Sc-G1.0-Ca se je k povečal, vendar ne drastično, Kc pa se je signifikantno zmanjšal. Iz kinetičnih in statističnih podatkov lahko povzamemo, da Δsst2 poveča občutljivost in intenziteto izhodnega signala.1

3. in 4. generacija

Čim manjša LOD in večja občutljivost biosenzorja sta ključna za uspešno diagnostiko oz. detekcijo v heterogenih vzorcih. C. Fan in sod. so v tretji generaciji biosenzorja Sc-G3.0-Ca zmanjšali LOD in Kc in tako še dodatno izboljšali delovanje biosenzorja. To so uspešno naredili z implementacijo pozitivne zanke v genetskem vezju, ki temelji na izražanju transkripcijskega aktivatorja GAL4. sTF sodeluje, poleg indukcije izražanja reporterskega gena, tudi pri izražanju transkripcijskega faktorja GAL4, ki dodatno ojača izražanje reporterskega gena pod kontrolo promotorja Pgal. Četrti sev Sc-G4.0-Ca pa ima uvedeno še mutacijo Δsst2. Po opazovanju fluorescence so lahko določili, da je pri sevu Sc-G4.0-Ca, v skladu s pričakovanji, zaradi prisotnosti pozitivne povratne zanke in Δsst2, LOD najnižja pri 0,25 pM, kar je 4000-krat manj kot v primeru seva Sc-G1.0-Ca, vrednost Kc pa se je v tem primeru znižala kar 7850-krat. Sc-G3.0-Ca ima rahlo višji k, kar so pripisali metabolni preobremenitvi kvasnih celic. Določili so tudi najnižjo mejo kvantifikacije (LOQ) za SC-G4.4-Ca in predhodnike. LOQ se je z generacijami pričakovano manjšala. Tako so potrdili, da je kaskadno ojačenje signala preko sTF učinkovito. V nobenem primeru po transformaciji s plazmidi ali urejanju genoma niso opazili kritičnega upada rasti celic.1

Delovanje biosenzorja pod različnimi pogoji

Sev SC-G4.4-Ca je dosegel eksperimentalno najboljše podatke – najnižji LOD in LOQ, najnižjo Kc in drug največji k. Če bi ta biosenzor teoretično sklopili z betaksantinskim reporterskim sistemom, nam bi podal najbolj zanesljive podatke, ali imamo v vzorcu prisotno C. albicans. Ker so za nadaljevanje raziskav želeli vedeti več o delovanju biosenzorja, so C. Fan in sod. preizkusili delovanje SC-G4.4-Ca pri različnih temperaturah in pri različnem pH. Ugotovili so, da je optimalna temperatura za delovanje biosenzorja 30 °C, odstopanja od te temperature so vplivala na zvišanje LOD in znižanje k. pH ni signifikantno vplival na LOD, LOQ in Kc; ob prisotnosti biosenzorja v okolju s pH nad 9, se je znižala maksimalna fluorescenca zaznave. Potrdili so, da zmerno nihanje temperature in pH minimalno vplivata na celični metabolizem in delovanje biosenzorja.1

Betaksantinski reporterski sistem

Betaksantinski reporterski sistem je sestavljen iz dveh kataliziranih korakov. Cilj reporterja je, da lahko rezultate opazujemo brez dodatne opreme, tj. s prostim očesom. Betaksantini so barvila, ki so prisotna v rdeči pesi, iz katere so tudi heterologno izrazili encim BvCYP76AD, ki pretvarja tirozin v L-DOPA, ki ga encim MjDOD pretvori v rumeno obarvano betalaminsko kislino. Barvo je mogoče še ojačati tako, da jo izpostavimo reakciji z aminokislinami oz. drugimi aminskimi donorji. Oba gena za reporterska encima sta bila na istem plazmidu pRS425CYP76AD5-DOD, s katerim so transformirali kvasne celice, ki so izražale Ca Ste2 in delovale kot biosenzor. Ni določeno, kateri sev kvasovk so uporabili, saj je betaksantinski reporter le predlagan način za vizualizacijo. Test so opravili v triplikatih, v vsako triado so dodali različne koncentracije faktorja Ca. Opazovali so obarvanje, ki je bilo vedno bolj intenzivno, z naraščajočo koncentracijo faktorja Ca.1

Zaključek

C. Fan in sod. so v procesu optimizacije znižanja detekcije in zvišanja intenzivnosti reporterskega signala pripravili štiri generacije biosenzorjev za zaznavanje C. albicans. To so dosegli na podlagi sinteznobiološkega modela minimizirane feromonske signalne poti GPCR, ki so jo prilagodili in optimizirali. Glavna sprememba, ki so jo uvedli, je sklopitev signalne poti z galaktoznim regulonom v sevu S. cerevisiae, ki je to omogočal. Ta korak je prispeval k poenostavitvi sistema in ukinjanju potencialne negativne regulacije s strani transkripcijskega faktorja Ste12, ki so ga zamenjali s hibridnim sTF. Šasija za zaznavo določenih antigenov je potrebovala receptor za antigene; v tem primeru so v kvasnih celicah izrazili Ca Ste2, ki je receptor iz C. albicans. Dodali so tudi sistem pozitivne povratne zanke, ki deluje na podlagi izražanja GAL4. Ta sistem je doprinesel k občutljivosti sistema in k intenziteti reporterskega signala. Dodatno so uvedli tudi delecijo v inhibitorju Gpa1, ki prav tako izboljša lastnosti biosenzorja.

Viri

1. Fan, C., He, N. & Yuan, J. Cascaded amplifying circuit enables sensitive detection of fungal pathogens. Biosens Bioelectron 250, (2024).

2. Fan, C. & Yuan, J. Reshaping the yeast galactose regulon via GPCR signaling cascade. Cell Reports Methods 3, 100647 (2023).

3. Shaw, W. M. et al. Engineering a Model Cell for Rational Tuning of GPCR Signaling. Cell 177, 782-796.e27 (2019).